毛艳++贺金华++王新堂++戎晓娟
摘要：意图 调查聚酰胺树脂别离纯化神香草提取液的最佳工艺条件。办法 以总黄酮和迷迭香酸为检测方针，选用单要素调查法挑选树脂纯化工艺中的最大上样量、水洗脱体积、洗脱剂用量、上样液浓度、树脂吸附时刻、上样液pH值和洗脱速率等参数。成果 最佳纯化工艺参数为：神香草提取液浓度为10 mg/mL，最大上样量为12 mL，水洗脱2 BV去除杂质，40%乙醇洗脱9 BV，上样液迷迭香酸浓度86.3 μg/mL、总黄酮浓度117.8 μg/mL左右，树脂吸附时刻为14 h，上样液pH值调至6.5，洗脱速度3.0 BV/h。定论 该办法简洁易行，别离效果杰出，适用于神香草提取液的别离纯化。
关键词：神香草；聚酰胺树脂；总黄酮；迷迭香酸；纯化工艺
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）09-
Research on Separation and Purification of Extract from Hyssopus cuspidatus Boriss. with Polyamide Resins MAO Yan， HE Jin-hua， WANG Xin-tang， RONG Xiao-juan （Xinjiang Institute of Materia Medica， Urumqi 830004， China）
Abstract： Objective To investigate the optimal process conditions for the separation and purification of extract from Hyssopus cuspidatus Boriss. by polyamide resins. Methods The total flavonoids and rosmarinic acid were used as the indexes. The maximum amount of sample solution， elution volume， concentration of sample solution， adsorption time of resin， loading time of sample solution and the amount of eluting solvent， pH and elution rate in the resin purification process were screened by single factor method. Results The optimal purification parameters were as follows： 10 mg/mL of extract， 12 mL of sample amount， 2 BV of water to remove impurities， 40% ethanol to elute 9 BV； the concentration of rosmarinic acid in sample solution was 86.3 μg/mL， and the total flavonoid concentration was 117.8 μg/mL； the resin adsorption time was 14 h； the pH of sample solution was 6.5； the elution rate was 3.0 BV/h. Conclusion This method is simple and feasible， fit for separating and purifying of extract from Hyssopus cuspidatus Boriss.
Key words： Hyssopus cuspidatus Boriss.； polyamide resins； total flavonoid； rosmarinic acid； purification process
神香草為唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatus Boriss.的枯燥地上部分，维吾尔名为“祖发奇尼”，是维吾尔族民间惯用药材[1]，性质干热，有很强的香味，具有镇咳、袪痰、平喘效果，作为维吾尔医和民间用药已有几百年前史，效果显著。以神香草为主药的寒喘祖帕颗粒收载于《中华人民共和国卫生部药品规范·维吾尔药分册》1999年版，在新疆维吾尔医院临床用于医治哮喘具有很好的效果。
神香草含有黄酮类、多糖及苷、酚酸类、甾醇类、萜类化合物以及醛类、脂类、有机酸[2-4]等。近年来，跟着别离纯化技能的前进，对神香草的化学成分有了
基金项目：新疆维吾尔自治区科技方案项目（201417107）
通讯作者：贺金华，E-mail：[email protected]
新的知道。赵军等[5]报导，神香草中含有很多黄酮类化合物，具有抗炎、抗过敏及按捺细菌的效果。迷迭香酸是神香草药材中质量分数较高的成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗血栓和按捺透明质酸酶等多种生物活性[6]。
本课题前期神香草抗哮喘有用部位谱效学实验显现，神香草具有很好的抗哮喘效果，且开端断定了其活性有用部位[7]。现在没有见选用聚酰胺吸附树脂处理、纯化神香草抗哮喘有用部位的报导。因而，本实验以迷迭香酸和总黄酮含量为方针，研讨神香草抗哮喘有用部位的聚酰胺别离纯化工艺，优选最佳工艺参数，为神香草抗哮喘有用部位纯化的中试和工业化大生产供给牢靠根据，也为神香草的制剂研讨奠定根底。
1 仪器与试药
UltiMate 3000系列高效液相色谱仪（包含二极管阵列检测器、四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、4～40 ℃恒温箱），美国Thermo Scientific Technologies公司；UV-2501PC型紫外分光光度计，日本岛津；DT500A型电子计数天平，常熟市金羊砝码仪器有限公司金羊天平仪器厂；DZF-6050型真空枯燥箱，上海精宏实验设备有限公司；BP211D型电子天平，德国Sartorius；RE-2000A旋转蒸腾仪，上海亚荣生化仪器厂。
迷迭香酸对照品（批号111871-201203，纯度98.6%）、芦丁（批号110885-200102）、木犀草素（批号111520-200504），我国食物药品检定研讨院；三裂鼠尾草素（批号MUST-15052611，纯度99.17%），成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher），其他试剂均为剖析纯。
野生神香草药材于2014年8月采自新疆阿尔泰区域，由本所何江副研讨员鉴定为唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatus Boriss.的枯燥地上部分。
2 办法与成果
2.1 方针性成分检测办法
2.1.1 紫外分光光度法测定总黄酮
2.1.1.1 对照品溶液的制备 取120 ℃枯燥至恒重的芦丁对照品适量，精细称定，加水制成每1 mL含195.4 ?g的溶液，即得。
2.1.1.2 线性联系 精细汲取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL置25 mL量瓶中[8]，加无水乙醇至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加无水乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，当即照紫外-可见分光光度法[2015年版《中华人民共和国药典》（一部）附录0401]，在500 nm波利益测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=0.013 4X-0.006 3，r=0.999。成果标明，总黄酮在11.72～46.90 μg/mL范围内线性联系杰出。
2.1.2 HPLC测定迷迭香酸
2.1.2.1 对照品溶液的制备 取迷迭香酸对照品适量，精细称定，加甲醇制成每1 mL含191.3 ?g的溶液，即得。
2.1.2.2 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，活动相为乙腈-0.1%甲酸（23∶77），检测波长为330 nm，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃。
2.1.2.3 规范曲线 精细汲取迷迭香酸对照品溶液0.15、0.5、1、2、4、6 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，摇匀，即得。别离精细汲取上述溶液各10 μL注入液相色谱仪，记载峰面积，以迷迭香酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=0.370 5X-0.079 3，r=1。成果标明，迷迭香酸在2.87～114.78 μg/mL范围内线性联系杰出。色谱图见图1。
2.2 聚酰胺树脂别离纯化工艺
2.2.1 聚酰胺树脂预处理 将聚酰胺树脂置于圆底烧瓶中，用95%乙醇加热回流提取3次，每次1 h，然后将树脂倒出并抽滤，在吸附柱内参加相当于装填树脂体积0.4～0.5倍乙醇，然后将聚酰胺树脂投入吸附柱中，使其液面至高于树脂约0.3 cm处，然后用2 BV/h乙醇淋洗树脂（应将树脂中的气体排出），并用蒸馏水以相同流速洗净乙醇，直到流出液没有醇味，备用。
2.2.2 上柱药液的制备 取神香草药材粗粉适量，参加16倍量50%乙醇，提取3次，每次1 h，提取液浓缩至无醇味，然后参加适量的蒸馏水，拌和均匀，过滤，制成适合质量浓度的神香草提取液（含原药材48 mg/mL，其间迷迭香酸浓度9.13 μg/mL、总黄酮浓度117.8 μg/mL）后备用。
2.2.3 最大上样量调查 取处理好的聚酰胺树脂3 g于1.5 cm×30 cm层析柱内，精细汲取上样液，以1 BV/h流速进行动态吸附，分段搜集流出液，每4 mL搜集1份，搜集6份后，每8 mL搜集1份，用水定容至10 mL容量瓶中，共搜集19份。每份流出液依法测定迷迭香酸和总黄酮含量，制作走漏曲线，见图2。可见，第4份搜集样即第16 mL时，总黄酮开端显着走漏（总黄酮走漏率6.39%），故断定最大上样体积为12 mL上样液。
2.2.4 水洗脱体积及洗脱结尾调查 课题组前期进行的神香草抗哮喘有用部位谱效学研讨成果显现，40%乙醇洗脱部位抗哮喘效果最好，所以本实验进一步调查水洗脱柱体积和洗脱结尾。
取处理好的聚酰胺树脂3 g，湿法装柱后上样12 mL，以1 BV/h流速进行动态吸附，先后用2 BV水、3 BV 20%乙醇、5 BV 40%乙醇、5 BV 60%乙醇洗脱，每1 BV为1份样品，别离核算各BV的吸附率和解吸率。吸附率（%）=（C0V0-C1Vl）/C0V0×100%，解吸率（%）=C2V2/（C0V0-C1Vl）×100%。C0为神香草提取液中方针成分的质量浓度，V0为神香草提取液体积，C1为残液中方针成分的质量浓度，V1为残液体积，C2为洗脱液中方针成分的质量浓度，V2为洗脱液体积。成果见表1。
由表1可知，方针洗脱部位40%乙醇洗脱液中，迷迭香酸的吸附率=100%、解吸率<50%，还需持续调查40%乙醇洗脱体积；水洗脱液中含有很多总黄酮，跟着水用量的添加，总黄酮损失率逐步添加，归纳考虑，断定水用量为2 BV。
2.2.5 40%乙醇洗脱柱体积调查 取处理好的聚酰胺树脂3 g，湿法装柱后上样12 mL，以1 BV/h流速进行动态吸附，顺次用2 BV水、3 BV 20%乙醇、11 BV 40%乙醇洗脱，分段搜集流出液，每1 BV为一流份，依法检测样品中迷迭香酸、总黄酮的吸附率和解吸率，成果见表2。
由表2可知，40%乙醇洗脱部位中迷迭香酸和总黄酮首要会集在前7个柱体积中，归纳时刻要素和生产本钱，终究决议搜集9个洗脱柱体积。
2.2.6 上样液浓度调查 取经预处理好的聚酰胺树脂3 g，平行取5份，湿法装柱。取上样液12 mL，其间后4份别离参加必定量的蒸馏水，稀释至质量浓度别离为16、20、24、32 mL，以1 BV/h吸附流速加于层析柱上，先用2 BV水洗脱后，再用3 BV 20%乙醇和9 BV 70%乙醇洗脱，分段搜集流出液，每1 BV为一流份，依法检测样品中迷迭香酸和总黄酮的解吸率，成果见图3。归纳考虑迷迭香酸和总黄酮的解吸率成果，终究选定上样液12 mL，即迷迭香酸浓度为86.3 μg/mL、总黄酮浓度为117.8 μg/mL。
2.2.7 吸附时刻调查 取处理好的聚酰胺树脂3 g，平行4份，湿法装柱后上样12 mL，别离调查吸附时刻0、2、4、14 h对迷迭香酸和总黄酮解吸率的影响，上样量及洗脱量按前述断定，其他条件同前，成果见图4。可见，上样液吸附14 h，迷迭香酸和总黄酮解吸率均较高。
2.2.8 上样液pH值调查 取处理好的聚酰胺树脂3 g（柱体积19 mL）于1.5 cm×30 cm层析柱内，平行5份，上样液用1 mol/L盐酸和1 mol/L NaOH溶液别离调至pH值为3、4.5、5.5、6.5、8，上样12 mL，静置过夜后，别离调查洗脱液对迷迭香酸、总黄酮解吸率的影响，上样量及洗脱量按前述断定，其他条件同前，成果见图5。可见，总黄酮解吸率在pH=3时最高，但迷迭香酸彻底未解吸，当上样液调pH=6.5时迷迭香酸和总黄酮解吸率均较高。
2.2.9 洗脱速率调查 取处理好的聚酰胺树脂3 g，平行4份，湿法装柱，上样液用1 mol/L NaOH溶液调pH 6.5，上样12 mL，静置过夜后，别离调查洗脱速度为1、2、3、4 BV/h对迷迭香酸、总黄酮解吸率的影响，上样量及洗脱量按前述断定，其他条件同前，成果见图6。可见，跟着流速的升高，迷迭香酸和总黄酮的解吸率逐步下降，归纳考虑时刻和经济本钱，终究决议选用洗脱流速为3 BV/h。
2.2.10 验证实验 取经处理好的聚酰胺树脂3 g，平行3份，湿法装柱，取质量浓度为10 mg/mL的神香草提取液12 mL上柱，按上述纯化工艺进行3次验证实验，搜集40%乙醇洗脱液，按“2.1.1”和“2.1.2”项下办法测定40%乙醇洗脱液中迷迭香酸和总黄酮含量并核算。成果迷迭香酸的解吸率别离为72.23%、69.84%、71.17%，平均为71.08%；总黄酮的解吸率为97.89%、98.99%、97.56%，平均为98.15%。标明该纯化工艺重复性杰出，所选工艺安稳可行。
3 评论
聚酰胺分子中含有丰厚的酰胺基，可与多酚类化合物的酚羟基构成氢键结合而被吸附，化合物分子中酚羟基数目越多吸附力越强；黄酮类化合物结构中的羟基和糖苷键等极性基团，易于与聚酰胺构成氢键而被吸附[9]，且聚酰胺树脂颗粒具有再生性好、挑选性高、操作简洁、解吸速度快的特色。因而，咱们挑选聚酰胺吸附树脂进行神香草中的黄酮类和酚类化合物的别离。
本课题组前期选用体外细胞培养技能检测神香草不同极性提取物和纯化物的体外抗炎活性，开端将HPLC指纹图谱和体外药效实验成果相结合，选用灰色关联度统计剖析办法对谱效联系进行了研讨，调查神香草不同极性提取物和纯化物HPLC指纹图谱特征峰对体外炎症因子和抗肿瘤坏死因子按捺效果的相关性，经过“谱效”联系研讨阐明神香草抗炎效果的药效物质根底，进一步得到神香草抗哮喘有用部位，为后期深度开发和使用神香草供给理论根据[7]。
本实验成果标明，最佳纯化工艺参数为：聚酰胺树脂别离纯化，上样液中迷迭香酸浓度为86.3 ?g/mL、总黄酮浓度为117.8 ?g/mL左右，上样液调pH值至6.5，吸附时刻为14 h，吸附速度为1.0 BV/h，洗脱速度为3.0 BV/h，水洗脱2 BV去除杂质，20%乙醇洗脱3 BV，40%乙醇洗脱9 BV。40%乙醇洗脱液蒸干后测定干浸膏质量，其间总黄酮和迷迭香酸的质量分数别离到达35.1%和3.7%以上。该工艺操作简略、重复性好，可作为别离纯化神香草提取液的有用办法，对后期研讨依从性较好的神香草新制剂工艺有必定的使用价值。
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（收稿日期：2017-02-13）
（修回日期：2017-03-20；修改：陈静）
