胡武杰 刘志明 吴斯敏 三军利 李建林
[摘要]意图：经过RNA搅扰乳腺癌MCF-7细胞组蛋白去乙酰化酶1（HDACI）基因，调查对其细胞周期及细胞成长的影响。办法：将乳腺癌MCF-7细胞分红3个组：空白对照组（不予任何处理）、阴性对照组（予以阴性siRNA+脂质体）、siRNA组（HDACl siRNA+脂质体）。人工组成针对HDACl基因的小分子搅扰RNA构建HDACI-siRNA重组质粒，经过脂质体转入乳腺癌MCF-7细胞。用Real Time-PCR法和Western-b10t法别离检测HDACl基因的mRNA及蛋白表达状况；MTT法检测细胞增殖状况；流式细胞术检测细胞周期改动。成果：转染24h后人乳腺癌MCF-7细胞中HDAClmRNA表达量在siRNA组为（0.15±0.02）、空白对照组为（1.00±0.03）、阴性对照组（0.83±0.04）。与空白对照组和阴性对照组比较，siRNA组细胞中HDAClmRNA表达量下降显着（P<0.05）。Western b1ot显现HDACl蛋白表达量亦显着显现：siRNA组表达量比空白和阴性对照组低（P<0.05）。MTT法检测显现3组细胞中，siRNA组的细胞成长速度较其他两组慢（P<0.05）。流式细胞术检测显现3组乳腺癌细胞细胞周期散布显现siRNA组细胞周期s期显着削减（P<0.05），G1期份额添加（P<0.05）。定论：经过RNA搅扰能有用的按捺人乳腺癌MCF-7细胞HDAC1的表达，一起按捺细胞增殖、引起细胞周期阻滞。
[关键词]HDAC1；细胞增殖；细胞周期
组蛋白乙酰化搬运酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC），是一对功用彼此拮抗的蛋白酶，一起担任调控组蛋白的乙酰化与去乙酰化。正常细胞体一旦出现核内组蛋白乙酰化与去乙酰化的失衡，即会导致正常的细胞周期与细胞代谢行为的改动而诱发肿瘤。已有研讨标明，因为这对拮抗酶活性的改动，导致组蛋白在转录水平反常润饰，导致反常表达。
在组蛋白去乙酰化酶很多亚型中，HDAC1在肿瘤的发作开展的联系中是具有代表性的。一起发现HDAC1的表达水平与患者生存率，肿瘤的巨细有关。因而HDAC1能够作为一个独立的乳腺癌临床预后目标。其机制或许因为下调HDAC1后，是HDAC1 mRNA和蛋白表达量削减。
本试验旨在经过RNA搅扰的手法，下调乳腺癌MCF-7细胞中HDAC1基因的表达，使HDAC1基因表达削减，然后按捺细胞增加、使细胞周期发作改动。
1材料与办法
1.1细胞及首要试剂
乳腺癌MCF-7细胞（上海生物工程公司）。DMDM（美国Gibco公司）；小鼠抗人HDAC1单克隆抗体及羊抗小鼠二抗购自（美国SANTA CRUZ）公司；脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；Real Time-PCR检测试剂盒购自（上海吉马技能制药有限公司）公司；胎牛血清购自（维森特生物技能有限公司）公司；双抗购自Gibco公司。
1.2首要的设备
CO2培育箱（3111，美国Thermo）、超净工作台（姑苏净化设备有限公司）、常温离心机（3300，德国Eppend～f公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、SDS-PAGE蛋白电泳仪（北京六一仪器厂）、PCR仪（美国Applied Biosystems公司）
1.3细胞培育
乳腺癌MCF-7细胞培育于含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培育液中，置于37℃、5%CO2体积分数的恒温培育箱中培育。
1.4 RNA搅扰片段的组成
siRNA序列托付上海吉玛公司组成，一起组成随机性阴性对照序列。HDAC1siRNA正义链：5'一GCUCCUCUGACAAACGAAUTT-3'，反义链5'-AUUCGUUUGUCAGAGGAGCTT-3'。阴性的siRNA正义链5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'反义链-5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。
RNA搅扰详细转染过程参照上海吉玛公司转染操作手册。转染6～7h后换成无双抗的DMEM培育液，之后惯例培育，转染24小时后做后续处理。
1.5 Real Time-PCR法检测乳腺癌HDAC1细胞中HDACl的表达
搜集转染后各组HDAC1细胞，选用Trizo法提取总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，检测HDAC1、β-actm'的表达。引物均由上海生工生物工程技能服务有限公司组成。β-actm'为内参照核算相对表达量（RQ）
1.5Western blot法测MCF-7细胞中HDAC1蛋白的表达
提取并别离各组总蛋白，将别离后的蛋白搬运至硝酸纤维膜上，关闭搬运膜，别离参加一抗（兔抗人HDAC1多克隆抗体以及β-actin单克隆抗体）反响过夜，随后参加二抗反响2小时暗室发光显影。以Quantity One v462图画剖析软件对图画进行剖析，以意图条带与β-actin灰度值的比值作为蛋白表达相对含量。
1.7细胞增殖检测
选用MTT法进行细胞增殖检测。取对数成长期的MCF-7细胞，接种在96孔培育板上，每孔细胞数1×105/孔。试验各组每组设5个平行孔。别离转染各组。于转染后（0h、24h、36h、48h、72h、96h）向每孔参加5mg/μlMTT溶液20μl。避光培育4小时，吸除上清液。每孔参加150μlDMSO，震动10分钟，使构成的晶体充沛溶解。测定570nm处吸光度（A）值，依据A值制作细胞成长曲线。
1.8流式细胞术检测细胞周期改动
搜集各组转染后的细胞，制备单细胞悬液，调整细胞密度为1×106个/mL；搜集各组细胞，随后用70%冰乙醇溶液涣散固定细胞；PBS洗刷后弃上清液，参加1%Triton X-100、0.01%RNase和0.005%PI的混合液，摇匀后静置25mm，用400目丝网过滤后上机剖析，检测细胞周期。
1.9核算学剖析
核算剖析选用SPSS13.0核算软件包完结，核算材料组间差异，选用方差剖析（ANOVA），组间两两比较选用S-N-K查验。以P<0.05为差异有核算学含义。
2成果
2.1 Real-Time PCR成果
HDAClsiRNA转染乳腺癌细胞36小时后，提取三组细胞的总RNA，以Real-TimePCR检测扩增曲线。空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组的表达量别离为（1.0±0.03）、（0.83±0.01）、（0.15±0.002）。与空白对照组和阴性对照组比较，siRN转染组细胞HDAC表达量显着下降（P<0.05）。标明细胞转染HDAClsiRNA后HDAClmRNA表达水平显着下降。
2.2 Western blotting检测HDAC1蛋白的表达
Western bloting成果显现：在空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组的三个组中，siRNA转染组的HDAC1基因显着下调，比较别的两组条带亮度显着要弱，参照GADPH，灰度剖析显现下降了59%，而空白对照组和阴性对照组的HDACI基因无显着改动，标明转染的反义基因有用的下调了HDAC1，阻断了其表达，如图1所示。
2.3细胞增殖检测
HDAClsiRNA瞬间转染对乳腺癌MCF-7细胞株增殖的影响。以MTT法检测乳腺癌MCF-7细胞株瞬间转染HDAClsiRNA 24h、36h、48h、72h后细胞的成长状况，与空白对照组和阴性对照组比较，siRNA组细胞的成长显着变慢（P<0.05），但空白对照组与阴性对照组无显着差异（P>0.05）。提示下调HDAC1的表达后，细胞的成长遭到按捺。
2.4细胞周期检测
转染乳腺癌细胞36小时后，用流式细胞术检测3组不同细胞周期的改动。如下表所示，与空白对照组与阴性对照组比较，经过RNA搅扰下调HDACl的表达，细胞周期出现了显着的改动，出现G1、G2期阻滞、s期削减，标明经过经过RNA搅扰下调HDACl的表达，有用的改动了siRNA转染组的细胞周期（P<0.05）。
3评论
在所有HDACs中，HDAC1与肿瘤的联系具代表性，有研讨者在肺腺癌、胃癌、HL-60细胞、胰腺癌、妇科肿瘤证明RNA搅扰HDAC1基因，能够下调HDAC1的表达，随之诱导细胞凋亡，按捺增殖。因为组蛋白乙酰化反常导致肿瘤的发作，导致转录水平发作反常，因而以此作为靶点医治是一种全新的医治途径。
经过试验将HDAC1基因缄默沉静后，可引起癌细胞有丝分裂削减，细胞凋亡增多，一起细胞的成长遭到必定程度的按捺，阻滞在G1或G2M期。Silvia等证明人肿瘤细胞缺少HDACl不能进行有丝分裂，而是经过Caspase-3激活途径进入凋亡，一起细胞周期阻滞在G1期或G2/M过渡期，然后按捺肿瘤细胞的成长，故除掉HDAC1的表达能按捺肿瘤成长。
在乳腺癌的试验研讨中，有人经过正向干涉HDAC1，成果显现组蛋白去乙醌化酶I（HDAC1）的表达可促进三阴性乳腺癌细胞的增殖。一起，构建的反义HDACI质粒导入MCF-7细胞，经过下调HDAC1基因，引起了细胞的增殖按捺及周期阻滞，标明HDAC1在乳腺癌MCF-7细胞中其乙酞化与去乙酸化润饰或许起重要效果。
本试验旨在经过RNA搅扰的手法，下调乳腺癌MCF-7细胞中HDAC1基因的表达，然后按捺细胞增加、使细胞周期发作改动。转染后发现转染组的HDAC1mRNA表达在搅扰后能出现显着的下降（P<0.05），HDAC基因蛋白的表达亦有显着的下降（P<0.05），标明经过RNA搅扰后能有用的阻断了HDAC1的表达。MCF-7细胞株转染后细胞增加比空白对照组和阴性对照组增加速度显着下降（P<0.05）。提示下调HDAC1的表达，细胞的成长遭到按捺。与空白对照组与阴性对照组比较，经过RNA搅扰下调HDAC1的表达，细胞周期出现了显着的改动，出现G1、G2期份额增高、s期份额削减，标明经过经过RNA搅扰下调HDAC1的表达，有用的改动了siRNA转染组的细胞周期（P<0.05）。
综上所述，HDAC1siRNA能有用按捺乳腺癌MCF-7细胞株HDAC1mRNA及蛋白的表达；在体外能有用按捺乳腺癌MCF-7细胞的成长增殖，诱导细胞周期发作阻滞。本研讨供给了HDAC1在乳腺癌细胞中的选择性效果谱，这为选择性靶基因医治开展供给了新的有力的途径。但HDAC1 siRNA按捺乳腺癌细胞增殖、诱导细胞周期阻滞的机制有待进一步研讨。
