吴宏斌+邱文娜+李磊+熊吉滨
[摘要]意图树立并验证胰蛋白酶裂解-反向高效液相色谱法进行重组艾塞那肽肽图剖析研讨。办法将重组艾塞那肽样品用胰蛋白酶水解，酶解所得的肽段经过反相高效液相色谱法进行剖析，选用cs色谱柱，以0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液为活动相A，以0.1%TFA的乙腈溶液为活动相B，梯度洗脱70min，得到重组艾塞那肽肽图，以此进行办法的专特色、重现性、定量限、批间同一性研讨。成果本实验室制备的重组艾塞那肽能够经过胰蛋白酶裂解RP—HPLC法进行肽图剖析，专特色、重现性均满足要求，定量限为0.125mg/mL，三个批次间的肽图谱也完全共同。定论标明此办法简洁牢靠、准确度高、重复性好，验证研讨可行，可用于重组艾塞那肽的质量操控。
[关键词]重组艾塞那肽；肽图；胰蛋白酶裂解；高效液相色谱；办法研讨；质量操控
艾塞那肽（Exendin-4）是毒蜥唾液腺中排泄的一种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物，为含有39个氨基酸的多肽。该产品初次由美国Amylin制药公司开发组成，现在国内市场由瑞典阿斯利康公司进口出售，在临床中已很多运用，下降餐后血糖作用好见效快，首要用于操控血糖，减轻体重，改进胰岛素反抗。现在该药品无其他公司出产，且无药典保藏质量规范。本实验室经过前期的研制，自主构建载体，运用基因工程技能在大肠杆菌体内重组表达艾塞那肽，经过纯化、浓缩、冻干等工艺，得到重组艾塞那肽。
现在，操控基因工程药物共同性的一个重要手法就是肽图剖析（peptide mapping analysis），肽图剖析技能活络高效的特色使其成为对基因工程药物的分子结构和遗传安稳性进行验证的首选办法。该技能不光能够比较重组与天然蛋白质结构之间的不同，还可协助判别样品在出产过程中是否发生了改动，以验证出产工艺和样品的安稳性，所以肽图剖析也是调查供试品与对照品之间以及不同批次产品之间同一性的重要手法。本研讨选用胰蛋白酶对重组艾塞那肽进行酶解，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行剖析，与组成艾塞那肽进行共同性比对，并对3批重组艾塞那肽进行了肽图剖析，树立重组艾塞那肽的质量操控办法以及验证研讨，得到较好的成果。
1仪器与试剂
1.1仪器
高效液相色谱仪（Agilent 1260）；电子天平（Sartorius BSA224S-CW）；超纯水仪（MilliporeMilli-Q）；超声仪（舒美KQ-300VDV）；真空泵（天津GM-0.50）；水浴锅（Fisher215）。
1.2试剂资料
乙腈（色谱醇，Fisher公司，LOTl36911）；三氟乙酸（剖析纯，sigma，BCBJ6836V）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢铵、醋酸等（剖析纯，国药集团化学试剂有限公司）；胰蛋白酶（Sigma，LOT#SLBFl700V）；艾塞那肽组制品（上海吉尔生化有限公司，批号P140218）；重组艾塞那肽（克己，批号Exl50108、Exl50322、Exl50603）；其他试剂均为剖析纯。
2办法与成果
2.1色谱条件
经重复实验后，断定重组艾塞那肽纯度测定的实验色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse C。（4.6x250mm，粒径5μm）；以0.1%三氟乙酸的水溶液为活动相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为活动相B液，梯度洗脱70min（A液从100%～30%，B液从0～70%）；流速110mL/min；柱温30℃；检测波长为214nm；进样量100μL；系统适用性要求满足。
2.2样品处理
取样品运用磷酸盐缓冲液进行溶解，使浓度约为1mg/mL，运用1%碳酸氢铵溶液进行透析，取2mL透析液，参加400μL经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的胰蛋白酶溶液（0.1 mg/mL，溶剂为1%碳酸氢铵溶液），37℃水浴保温20h后，参加240μL50%醋酸溶液，混匀后用0.45μm滤膜滤过，取滤过液进样。
2.3专特色研讨
取重组艾塞那肽、组成艾塞那肽以及空白溶液按照上法同步操作，液相色谱仪上样，记载色谱图，成果见图1，空白溶液中（A）只要溶剂峰，重组艾塞那肽（C）与组成艾塞那肽（B）酶解后的肽段峰共同。成果标明运用HPLC法对艾塞那肽进行肽图剖析的专特色研讨满足要求，运用基因工程技能表达出的重组样品具有与组成样品共同的一级结构。
2.4重现性研讨
职工A取重组艾塞那肽按照上法操作，液相色谱仪上样，重复实验3次（每样进2针）；职工B于另一天同法操作，重复实验3次（每样进2针）。记载色谱图，选取色谱图中5个主峰，核算峰面积及相对保存时刻进行比对，成果见表1。从表中数据可知，各峰面积及相对保存时刻CV值均≤2.0%，标明本实验室样品重组艾塞那肽适用胰蛋白酶裂解-RP-HPLC法进行肽图剖析，而且成果准确度高、重复性好。
2.5定量限
取重组艾塞那肽样品，按照上法操作，滤过液运用1%碳酸氢铵溶液倍比稀释，别离稀释为原浓度的1/2、1/4、1/8、1/16，取稀释液别离进样，记载色谱图，取5个主峰为研讨目标。经过图谱剖析，1/8浓度稀释液中，5个主峰中最小峰信噪比为11，满足药典办法验证“信噪比≥10：1”的要求，因而本实验室重组艾塞那肽进行肽图查看的定量限设为0.125mg/mL。
2.6批间同一性研讨
按上述办法对接连3批重组艾塞那肽（批号为Exl50108、Exl50322、Exl50603）进行肽图剖析，各批样品图谱共同，剖析成果见图2。标明本实验室经过大肠杆菌重组的艾塞那肽表达安稳，多肽结构具有共同性，胰蛋白酶裂解RP-HPLC法可用于重组艾塞那肽的辨别剖析和质量操控。
3评论
按生物仿制药上市要求，我国企业出产的产品质量规范应不低于国外原研产品，其药物分子结构应与原研产品共同，经过肽图剖析严厉保证每一批次终产物的共同性和安全性，然后有用地操控基因工程药物的产品质量。现在上市艾塞那肽产品是经过组成的办法取得，本实验室经过基因工程办法制备生物仿制药，一方面为了探索重组艾塞那肽的可行性下降成本，另一方面为研讨长效重组GLP-1药物打下根底。
3.1办法学验证
现在药典法定办法有胰蛋白酶裂解一反向高效液相色谱法和溴化氰裂解法，前者具有更高分辨率及检测活络度，在蛋白质及多肽别离剖析中得到广泛运用，因而重组艾塞那肽的肽图剖析选用胰蛋白酶裂解一反向高效液相色谱法。经查肽图查看作为一项重要的定性剖析，很少有关于其办法学验证的文章，本实验在重现性研讨中选取了5个代表性首要峰的出峰时刻和峰面积，核算变异系数CV，由所以不同实验人员之间成果比较，因而未运用RSD标明。定量限研讨中也是取的5个主峰中最小峰信噪比，峰数的挑选应当视肽图图谱而定，一般肽图峰数少的情况下能够少取，但不该少于3个特征主峰。
3.2实验条件探索
为保证重组艾塞那肽在预处理过程中的安稳性，本实验将样品在4℃环境中进行透析，透析后的样品弄清，未见任何混浊和沉积现象。在色谱条件探索过程中，运用色谱柱cx和clx对样品进行肽图剖析，图谱作用适当，Cx的别离度更好。经过紫外可见分光光度计全波长扫描，裂解液在214nm波长下有最大吸收峰，与理论值共同。因为七氟丁酸较为贵重，本实验选用了三氟乙酸-乙睛-水系统，经过梯度洗脱能够到达满足的别离作用。别的柱温文流速的改动对该样品肽图的测定影响不大，因而选用了药典辅导值。
3.3成果剖析
RP-HPLC色谱图比对成果标明，本实验室经过重组表达的艾塞那肽肽图与组成的对照品共同，不同批次间的肽图谱也完全共同。该研讨标明本实验室制备的重组艾塞那肽能够经过胰蛋白酶裂解-RP-HPLC法进行肽图辨别，对产品进行质量操控，而且办法简洁牢靠、准确度高、重复性好，办法验证研讨可行，为该药物的研制出产及申报供给杰出的支撑和质控规范。
在专特色研讨中，重组艾塞那肽比起组成艾塞那肽，在相对保存时刻28min和32min左右有两个小峰。经研讨重组艾塞那肽的纯度在95.4%，低于组成的98.8%，两峰开始考虑为表达纯化过程中未能有用去除的杂质峰。实验室下一步将改进纯化工艺进步样品纯度，一起对相关杂质进行剖析研讨。
