刘新亚等
[摘要]意图经过研讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后水通道蛋白4（AQP4）、蛋白激酶C（PKC）表达水平的改动，来评论两者与脑水肿之间的联系。办法经过线栓法仿制大鼠大脑中动脉缺血（MCAO）再灌注模型，动物随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、缺血再灌注组（CIR）。参照Garcia JH法进行神经功用残缺评分、用Elliot法检测脑安排含水量、免疫组化法检测AQP4及PKC的表达。成果CIR后6h即有神经功用残缺，脑含水量在CIR12h显着升高，1～3d时到达顶峰；AQP4表达在前期水平下降，从12h逐步升高，至CIR 24h显着升高，3d达顶峰；PKC在CIR后6h开端继续性升高，至第5d仍坚持较高水平。定论前期的细胞源性脑水肿或许和PKC的升高有关，后期的血管源性脑水肿或许和AQP4的升高相关。
[关键词]水通道蛋白4；蛋白激酶C；脑水肿
中图分类号：R743.3文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）06_0456_03
[Abstract] Objective By studying the changes of expression levels of aquaporin4 （AQP4） and protein kinase C （PKC） after focal cerebral ischemia_reperfusion in rats to investigate the relation among AQP4， PKC and brain edema. Methods The model of middle cerebral artery （MCA） of rats was duplicated by using the suture method. The rats were randomly divided into normal control group （Norm）， sham_operation group （Sham）， cerebral ischemia reperfusion group （CIR）. Scores of neurofunctional defect were graded according to Garcia JH method， Elliot method was used to measure water content in brain tissue， the expression of AQP4 and PKC in brain tissue was observed by immunohistochemistry. Results After cerebral ischemia_reperfusion （CIR）， Neurofunctional defect occurred after 6h. Water content in brain tissue increased after CIR 12h， which was up to highest point after 1_3days. The expression levels of AQP4 decreased in early， then the levels increased gradually since 12h later， obviously increased CIR24 h， and to highest point after 3 days. While PKC increased gradually after CIR6h， and kept high level for 5 days. Conclusions Early Cell_derived brain edema may relate to the rise of PKC； upper vasogenic brain edema may be related to the rise of AQP4.
[Key words] Aquaporin4 （AQP4）； Protein Kinase C （PKC）； Brain edema
水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）与脑水肿联系密切[1]，AQP4是散布在脑安排中主要与水通透有关的水通道蛋白，具有选择性的水转运功用。现在对AQP4在水分子转运及水平衡调理进程中详细效果机制越来越被很多学者重视：AQP4参加了脑缺血再灌注（cerebral ischemic reperfusion，CIR）后脑水肿的构成[2]。研讨发现AQP4的效果机制与G蛋白有关，而蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是G蛋白信号通路的中心分子之一，PKC或PKC的激活剂能够按捺AQP4的表达[3]；但也有试验证明，在脑危害后，PKC表达水平升高，促进兴奋性氨基酸、自由基等的开释，加剧神经元缺血性危害，直接参加并加剧了脑水肿的构成[4]。为此，咱们以大鼠大脑中动脉缺血（MCAO）再灌注模型为研讨方针，研讨AQP4、PKC在不一起相上的动态改动与脑水肿的联系，来说明两者在脑水肿中的效果和相互联系。
1资料与办法
1.1试验动物及分组：由南京青龙山试验动物饲养中心供给，健康雄性SD大鼠72只，鼠龄3～4个月，体重在280～330g，等级：cl，术中、术后逝世或神经功用评分未达要求者由备用组弥补，详细分组见表1。
1.3办法：线栓法制造大鼠大脑中动脉堵塞缺血再灌注（MCAO/R）模型，缺血2h后，康复再灌注，假手术组行相同手术，但置入线栓深度小于10mm。参照Garcia JH[5]的办法对一切试验大鼠进行神经功用评分，最高评分为18分、最低为3分；选用Elliot公式核算脑安排含水量，脑安排含水量=（湿重-干重）/湿重×100%；选用SABC法行免疫安排化学染色，成果断定根据染色强度和阳性方针的数量不同进行评分，评分分为0～7、共8个等级。
1.4计算学处理：运用SPSS17.0版计算软件进行计算学处理，试验数据以（x-±s）表明，多组均数间的比较选用单因素方差剖析，方差不齐时，用Tamhane's T2查验。均数间的两两比较选用q查验，双变量联系选用直线相关剖析，显著性水准均为α=0.05，P<0.05为差异有计算学含义。
2成果试验数据成果见表2：假手术组与正常对照组AQP4水平差异无计算学含义（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平呈现了下降，CIR 12h起水平逐步升高，24h时显着升高，与正常脑安排水平的差异具有计算学含义（P<0.05）；至CIR 3d时到达峰值，至第5d虽有所下降，但仍维持在较高水平；神经功用残缺评分自CIR 6h即显着下降，脑含水量在CIR 12h改动显着（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就现已有显着升高，继续至第5天仍坚持较高水平。由此能够看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情况下，水肿就现已显着发作，提示此刻参加脑水肿构成的或许主要是PKC。
3评论AQP4常表达于星形胶质细胞和室管膜细胞，尤其是与毛细血管和软脑膜触摸的胶质细胞膜处，参加了脑缺血/出血、脑伤口及脑肿瘤等继发的脑水肿的构成进程，但有关试验成果及机制的观念一向存在争议。近几年的许多试验的成果逐步趋向以为AQP4在缺血后脑水肿中表达增多可加剧脑水肿，表达削减可减轻脑水肿[6]。关于AQP4表达的调理亦不很清楚，试验发现内皮素、镁离子、黄体酮、钙离子、氯醌、丙泊酚及烟酰胺等药物可对其发挥调理效果[7，8]，但最有说服力的是蛋白激酶C（PKC），能够经过磷酸化的方法调理AQP4的活性，Harada等[9]研讨了鼠CIR后PKC活性的改动，发现缺血20min再灌注前期，海马区放射活性显着增高，再灌注6～12h放射活性达最顶峰，7d后放射活性下降，并且活性升高的PKC存在膜搬运现象，即细胞膜的PKC活性升高，而细胞浆的活性相对下降，估测是机体的维护性应激反响，为膜的易位激活，考虑到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此刻的AQP4水平也呈现了下降，更能显现出PKC对AQP4活性的按捺，使咱们能够估测出其膜搬运的含义在于本身调控AQP4的表达，减轻脑水肿，为机体坚持最适合的内环境。但PKC激活后可促进兴奋性氨基酸开释，加剧神经元缺血性危害，可引起细胞源性脑水肿。结合本试验，PKC在CIR危害的病理生理机制中或许扮演的人物：在CIR前期机体经过本身调理PKC表达添加，经过磷酸化的方法使AQP4失活，减轻脑水肿，是一种维护性反响，过早按捺PKC或许加剧脑水肿，正如许多学者发现，前期运用钙离子拮抗剂如尼莫地平，并不能削减AQP4表达，不能减轻脑水肿，因PKC是一种Ca2+依靠的丝氨酸蛋白激酶，随缺血再灌注时刻的延伸，各种危害因子继续效果以及神经元细胞坏死，超出机体代偿规模，PKC不能有效地削减AQP4表达，AQP4增多，致血脑屏障损坏，引起严峻的血管源性脑水肿，也就是前期以细胞源性脑水肿为主，后期以血管源性水肿为主，一起随同细胞源性脑水肿。经过PKC激活剂可削减AQP4表达，但能否减轻脑水肿尚待进一步研讨。
参考文献
[1]汪汇，方帆，江华.AQP4在中枢神经系统中效果的研讨进展[J].中华神经医学杂志，2012，（5）：531-534.
[2]Tait MJ， Saadoun S， Bell BA， et al. Increased brain edema in AQP4_null mice in an experimental model of subarachnoid hemorrhage[J]. Neuroscience，2010，167（1）：60-67.
[3]Zhu SM， Xiong XX， Zheng YY， et al. Propofol inhibits aquaporin 4 expression through a protein kinase C_dependent pathway in an astrocyte model of cerebral ischemia/reoxygenation[J]. Anesth Analg，2009，109（5）：1493-1499.
[4]Hoshi A， Yamamoto T， Shimizu K， et al. Chemical preconditioning_induced reactive astrocytosis contributes to the reduction of post_ischemic edema through aquaporin_4 downregulation[J]. Exp Neurol，2011，227（1）：89-95.
[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.
[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.
[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.
[8]陈应柱，张娴娴，沈雪.丁基苯酞对放射性脑危害模型大鼠皮质AQP4表达影响的调查[J].中华肿瘤防治杂志，2013，（2）：93-96.
[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.
（收稿日期：2014_6_23）
1.4计算学处理：运用SPSS17.0版计算软件进行计算学处理，试验数据以（x-±s）表明，多组均数间的比较选用单因素方差剖析，方差不齐时，用Tamhane's T2查验。均数间的两两比较选用q查验，双变量联系选用直线相关剖析，显著性水准均为α=0.05，P<0.05为差异有计算学含义。
2成果试验数据成果见表2：假手术组与正常对照组AQP4水平差异无计算学含义（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平呈现了下降，CIR 12h起水平逐步升高，24h时显着升高，与正常脑安排水平的差异具有计算学含义（P<0.05）；至CIR 3d时到达峰值，至第5d虽有所下降，但仍维持在较高水平；神经功用残缺评分自CIR 6h即显着下降，脑含水量在CIR 12h改动显着（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就现已有显着升高，继续至第5天仍坚持较高水平。由此能够看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情况下，水肿就现已显着发作，提示此刻参加脑水肿构成的或许主要是PKC。
3评论AQP4常表达于星形胶质细胞和室管膜细胞，尤其是与毛细血管和软脑膜触摸的胶质细胞膜处，参加了脑缺血/出血、脑伤口及脑肿瘤等继发的脑水肿的构成进程，但有关试验成果及机制的观念一向存在争议。近几年的许多试验的成果逐步趋向以为AQP4在缺血后脑水肿中表达增多可加剧脑水肿，表达削减可减轻脑水肿[6]。关于AQP4表达的调理亦不很清楚，试验发现内皮素、镁离子、黄体酮、钙离子、氯醌、丙泊酚及烟酰胺等药物可对其发挥调理效果[7，8]，但最有说服力的是蛋白激酶C（PKC），能够经过磷酸化的方法调理AQP4的活性，Harada等[9]研讨了鼠CIR后PKC活性的改动，发现缺血20min再灌注前期，海马区放射活性显着增高，再灌注6～12h放射活性达最顶峰，7d后放射活性下降，并且活性升高的PKC存在膜搬运现象，即细胞膜的PKC活性升高，而细胞浆的活性相对下降，估测是机体的维护性应激反响，为膜的易位激活，考虑到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此刻的AQP4水平也呈现了下降，更能显现出PKC对AQP4活性的按捺，使咱们能够估测出其膜搬运的含义在于本身调控AQP4的表达，减轻脑水肿，为机体坚持最适合的内环境。但PKC激活后可促进兴奋性氨基酸开释，加剧神经元缺血性危害，可引起细胞源性脑水肿。结合本试验，PKC在CIR危害的病理生理机制中或许扮演的人物：在CIR前期机体经过本身调理PKC表达添加，经过磷酸化的方法使AQP4失活，减轻脑水肿，是一种维护性反响，过早按捺PKC或许加剧脑水肿，正如许多学者发现，前期运用钙离子拮抗剂如尼莫地平，并不能削减AQP4表达，不能减轻脑水肿，因PKC是一种Ca2+依靠的丝氨酸蛋白激酶，随缺血再灌注时刻的延伸，各种危害因子继续效果以及神经元细胞坏死，超出机体代偿规模，PKC不能有效地削减AQP4表达，AQP4增多，致血脑屏障损坏，引起严峻的血管源性脑水肿，也就是前期以细胞源性脑水肿为主，后期以血管源性水肿为主，一起随同细胞源性脑水肿。经过PKC激活剂可削减AQP4表达，但能否减轻脑水肿尚待进一步研讨。
参考文献
[1]汪汇，方帆，江华.AQP4在中枢神经系统中效果的研讨进展[J].中华神经医学杂志，2012，（5）：531-534.
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[4]Hoshi A， Yamamoto T， Shimizu K， et al. Chemical preconditioning_induced reactive astrocytosis contributes to the reduction of post_ischemic edema through aquaporin_4 downregulation[J]. Exp Neurol，2011，227（1）：89-95.
[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.
[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.
[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.
[8]陈应柱，张娴娴，沈雪.丁基苯酞对放射性脑危害模型大鼠皮质AQP4表达影响的调查[J].中华肿瘤防治杂志，2013，（2）：93-96.
[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.
（收稿日期：2014_6_23）
1.4计算学处理：运用SPSS17.0版计算软件进行计算学处理，试验数据以（x-±s）表明，多组均数间的比较选用单因素方差剖析，方差不齐时，用Tamhane's T2查验。均数间的两两比较选用q查验，双变量联系选用直线相关剖析，显著性水准均为α=0.05，P<0.05为差异有计算学含义。
2成果试验数据成果见表2：假手术组与正常对照组AQP4水平差异无计算学含义（P>0.05）；在CIR后6h，AQP4水平呈现了下降，CIR 12h起水平逐步升高，24h时显着升高，与正常脑安排水平的差异具有计算学含义（P<0.05）；至CIR 3d时到达峰值，至第5d虽有所下降，但仍维持在较高水平；神经功用残缺评分自CIR 6h即显着下降，脑含水量在CIR 12h改动显着（P<0.05）；而PKC在CIR 6h就现已有显着升高，继续至第5天仍坚持较高水平。由此能够看出在CIR6_12h，AQP4水平尚低的情况下，水肿就现已显着发作，提示此刻参加脑水肿构成的或许主要是PKC。
3评论AQP4常表达于星形胶质细胞和室管膜细胞，尤其是与毛细血管和软脑膜触摸的胶质细胞膜处，参加了脑缺血/出血、脑伤口及脑肿瘤等继发的脑水肿的构成进程，但有关试验成果及机制的观念一向存在争议。近几年的许多试验的成果逐步趋向以为AQP4在缺血后脑水肿中表达增多可加剧脑水肿，表达削减可减轻脑水肿[6]。关于AQP4表达的调理亦不很清楚，试验发现内皮素、镁离子、黄体酮、钙离子、氯醌、丙泊酚及烟酰胺等药物可对其发挥调理效果[7，8]，但最有说服力的是蛋白激酶C（PKC），能够经过磷酸化的方法调理AQP4的活性，Harada等[9]研讨了鼠CIR后PKC活性的改动，发现缺血20min再灌注前期，海马区放射活性显着增高，再灌注6～12h放射活性达最顶峰，7d后放射活性下降，并且活性升高的PKC存在膜搬运现象，即细胞膜的PKC活性升高，而细胞浆的活性相对下降，估测是机体的维护性应激反响，为膜的易位激活，考虑到PKC可使AQP4磷酸化而失活，此刻的AQP4水平也呈现了下降，更能显现出PKC对AQP4活性的按捺，使咱们能够估测出其膜搬运的含义在于本身调控AQP4的表达，减轻脑水肿，为机体坚持最适合的内环境。但PKC激活后可促进兴奋性氨基酸开释，加剧神经元缺血性危害，可引起细胞源性脑水肿。结合本试验，PKC在CIR危害的病理生理机制中或许扮演的人物：在CIR前期机体经过本身调理PKC表达添加，经过磷酸化的方法使AQP4失活，减轻脑水肿，是一种维护性反响，过早按捺PKC或许加剧脑水肿，正如许多学者发现，前期运用钙离子拮抗剂如尼莫地平，并不能削减AQP4表达，不能减轻脑水肿，因PKC是一种Ca2+依靠的丝氨酸蛋白激酶，随缺血再灌注时刻的延伸，各种危害因子继续效果以及神经元细胞坏死，超出机体代偿规模，PKC不能有效地削减AQP4表达，AQP4增多，致血脑屏障损坏，引起严峻的血管源性脑水肿，也就是前期以细胞源性脑水肿为主，后期以血管源性水肿为主，一起随同细胞源性脑水肿。经过PKC激活剂可削减AQP4表达，但能否减轻脑水肿尚待进一步研讨。
参考文献
[1]汪汇，方帆，江华.AQP4在中枢神经系统中效果的研讨进展[J].中华神经医学杂志，2012，（5）：531-534.
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[3]Zhu SM， Xiong XX， Zheng YY， et al. Propofol inhibits aquaporin 4 expression through a protein kinase C_dependent pathway in an astrocyte model of cerebral ischemia/reoxygenation[J]. Anesth Analg，2009，109（5）：1493-1499.
[4]Hoshi A， Yamamoto T， Shimizu K， et al. Chemical preconditioning_induced reactive astrocytosis contributes to the reduction of post_ischemic edema through aquaporin_4 downregulation[J]. Exp Neurol，2011，227（1）：89-95.
[5]Noel G， Stevenson S， Moukhles H. A high throughput screen identifies chemical modulators of the laminin_induced clustering of dystroglycan and aquaporin_4 in primary astrocytes[J]. PLoS One，2011，6（3）：1-13.
[6]Fazzina G， Amorini AM， Marmarou CR， et al. The Protein Kinase C Activator Phorbol Myristate Acetate Decreases Brain Edema by Aquaporin 4 Down_Regulation after Middle Cerebral Artery Occlusion in the Rat [J]. J Neurotrauma，2010，27（1）：453-461.
[7]Thrane AS， Rappold PM， Fujita T， et al. Critical role of aquaporin_4（AQP4） in astrocytic Ca2+ signaling events elicited by cerebral edema[J]. Proce Natio Aca Sci，2011，108（2）：846-851.
[8]陈应柱，张娴娴，沈雪.丁基苯酞对放射性脑危害模型大鼠皮质AQP4表达影响的调查[J].中华肿瘤防治杂志，2013，（2）：93-96.
[9]Harada K， Maekawa T， Shama KM， et al. Translocation and down_regulation of protein kinase C_alpha， _beta， and _gamma isoforms during ischemia_reperfusion in rat brain[J]. Neurochem，1999，72（6）：2556-2564.
（收稿日期：2014_6_23）
