施伟丽 袁蓉 信琪琪 徐磊 滕传震 丛伟红
【摘要】讨论松龄血脉康胶囊对高血压状态下大鼠氧化应激损害的维护效果及机制。将自发性高血压大鼠随机分为模型组、氯沙坦钾组、松龄血脉康高剂量组和、松龄血脉康惯例剂量组，Wistar Kyoto大鼠（WKY）作为正常对照组，接连给药9周。生化法检测血清中氧化应激因子NO浓度、SOD生机、MDA含量。以Masson染色调查药物对大鼠主动脉病理安排形态学影响。凭借qPCR阵列技能检测氧化应激相关因子RNA水平的改变，继而凭借String及KEGG Pathway数据库对差异基因进行网络剖析。与对照组比较，高血压模型组血清NO浓度显着下降（P<0.01），MDA浓度显着升高（P<0.05），提示自发性高血压大鼠血清氧化才能增强。给药后，与模型组比较，氯沙坦钾组、松龄血脉康大剂量组、松龄血脉康中剂量组MDA浓度均显着下降（P均<0.001）。各组间SOD生机未见显着改变（P>0.05）。qPCR阵列检测成果显现，与模型组比较，高剂量松龄血脉康组共得到9个差异倍数大于2的基因，其间Gch1、FOS、IGF1R基因表达量上调，PIK3CG、GPx2、CAV1、SOD1、PTEN、HSPA1B表达量下调。其间CAV1和IGF1R与氧化应激密切相关，松龄血脉康胶囊或许经过调理CAV1和IGF1R基因表达，减轻高血压状态下大鼠主动脉氧化应激损害。
【要害词】松龄血脉康胶囊；自发性高血压大鼠；氧化应激
【中图分类号】R544.1 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-6681.2018.6..04
【Abstract】To investigate the protective effect and mechanism of Songling Xuemaikang Capsule（SXC）on oxidative stress injury in spontaneously hypertensive rats（SHR）.SHR were randomly divided into model group，high dose SXC group （H-SXC），normal dose SXC group （ N-SXC） and losartan group，and WKY rats served as control.Rats were administered continuously for 9 weeks.Oxidative stress related factors including NO，SOD and MDA were detected by biochemical method.Masson staining was used to observe pathological morphology of the aorta.QPCR array technique was used to detect changes of oxidative stress related factors， and then network of differential genes were analyzed with String and KEGG Pathway databases. Compared with the control group， NO concentration of model group was significantly descended （P<0.01），and the concentration of MDA increased obviously （P<0.05）.Compared with model group，concentration of MDA in losartan group，H-SXC and N-SXC were decreased significantly（P<0.001）.There was no statistical significance for SOD activity in each group （P>0.05）.75 variable genes were screened through qPCR array detection.Compared with the model group，H-SXC group received 9 differentially expressed genes，which fold change was more than 2.And Gch1， FOS and IGF1R gene expression were up regulated， while PIK3CG， GPx2， CAV1，SOD1，PTEN and HSPA1B were down regulated.H-SXC can alleviate oxidative stress by regulating genes expression of CAV1 and IGF1R in hypertensive rats.
【Key words】Songling xuemaikang capsule；Spontaneously hypertensive rats；oxidative stress
血管收縮和舒张功用障碍是血压反常的要害环节，氧化应激是血管损害的重要要素。越来越多的研讨提示，氧化应激参加高血压病的发作和开展，其机制或许与氧化损害血管内皮，影响血管功用有关[1-2]。这也提示，药物经过调理血管氧化应激水平、康复血管功用，或许成为医治高血压病新的探究方向。本课题组前期试验成果表明松龄血脉康胶囊能下降自发性高血压大鼠的血压[3]，一起提示其降压效果或许与抗氧化应激有关。故本研讨凭借qPCR阵列技能及String数据库，以自发性高血压大鼠为模型，进一步研讨松龄血脉康对血管的维护效果，以期为松龄血脉康的临床使用供给参阅。
1 材料
1.1 试验动物
9周龄SPF级雄性Wistar Kyoto大鼠（WKY）10只，自发性高血压大鼠40只，均购自北京维通利华试验动物有限公司，合格证书号SYXK（京）2012-0012。养殖于我国中医科学院西苑医院SPF级动物房，自在饮水及取食。
1.2 试验药物及试剂
松龄血康胶囊由成都康弘有限公司供给（批号160216），该胶囊首要由鲜松叶、葛根、珍珠层粉组成，0.5 g/粒；氯沙坦钾片由杭州默沙东制药有限公司供给（批号L016172），100 mg/粒。
1.3 试剂
一步法NO试剂盒（批号A013-2）、丙二醛（MDA）测验盒（批号20160804）、SOD试剂盒（WST-1法）（批号A001-3）均购自南京建成生物有限公司。RNA提取试剂盒（批号11667165001）购自Roche公司，All-in-One? First-Strand cDNA 组成试剂盒（批号AORT-0050），All-in-OneTM qPCR Mix及引物（批号AOPR-0200），购自GeneCopoeia公司。
1.3 试验仪器
脱水机（武汉豪杰电子有限公司：JJ-12J），包埋机（武汉豪杰电子有限公司：JB-P5），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司：RM2016），安排摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司：KD-P），烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司：DHG-9140A），酶标仪（Biotek：Stnergy-4），正置光学显微镜（日本尼康：ECLIPSE CI），成像体系（日本尼康：DS-U3），LightCycler480 PCR仪（美国罗氏）。
2 试验办法
2.1 分组及给药办法
40只9周龄雄性自发性高血压大鼠适应性养殖1周后，随机分为4组（模型组、氯沙坦钾组、高剂量松龄血脉康组和惯例剂量松龄血脉康组），每组10只，以WKY大鼠为正常对照组。氯沙坦钾片研磨后按每天31.5 mg·kg-1灌胃给药，高剂量松龄血脉康组以每天1g·kg-1灌胃，惯例剂量松龄血脉康组以每天0.5g·kg-1灌胃，模型组及正常对照组给予等体积生理盐水，给药9周。
2.2 病理安排学检测
胸主动脉用福尔马林固定、石腊包埋、切片后Masson染色，调查主动脉纤维化程度。
2.3 血清氧化因子检测
血清NO、SOD和MDA检测均用南京建成生物工程研讨所制备的试剂盒，其间NO选用硝酸还原酶法，SOD生机测定用黄嘌呤氧化酶法，MDA检测用硫代巴比妥酸法。操作按试剂盒说明书要求进行，依据各孔的吸光度核算浓度及生机。
2.4 qPCR阵列检测
模型组和高剂量松龄血脉康胶囊组分别供给5个主动脉安排，用All-in-OneTM first-strand cDNA synthesis试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA；后将All-in-OneTM qPCR mix与cDNA模板混合，将混合液滴入qPCR阵列孔中；Real-time PCR仪中反响；用GeneCopoeia的网上数据剖析东西剖析数据。
2.5 所得差异基因的网络剖析
结合String（http：//www.string-db.org）数据库对所得基因进行网络剖析。
2.6 数据计算办法
选用SPSS 20.0计算软件对数据进行剖析，计量材料以“x±s”表明，选用t查验；计数材料以例数（n），百分数（%）表明，选用x2查验。以P<0.05为差异有计算学含义。
3 结 果
3.1 松龄血脉康胶囊对主动脉纤维化程度影响
经过马松染色能够调查主动脉纤维化程度，从图1-A2、B2中能够看出模型组主动脉内里膜厚度添加，一起胶原纤维增生显着（蓝绿色胶原纤维增生显着，掩盖正常赤色肌纤维）。药物干预后与模型组比较，氯沙坦钾组、松龄血脉康高剂量组主动脉内里膜厚度减小，一起胶原纤维增生程度减轻，赤色滑润肌纤维尚明晰（见图1）。
3.2 松龄血脉康胶囊对血清中氧化应激因子的影响
NO水平的消长是调理氧化和抗氧化的要害环节，与对照组比较，高血压模型组血清NO浓度显着下降（P<0.01），MDA浓度显着升高（P<0.05），提示自发性高血压大鼠血清氧化才能增强。各组间SOD生机未见显着改变（P>0.05）。给药后，与模型组比较，氯沙坦钾组NO浓度显着升高（P<0.01），MDA浓度显着下降（P<0.001）。松龄血脉康大剂量组和中剂量组MDA浓度较模型组均显着下降（P<0.001），NO浓度较模型组有升高趋势，但未见显着计算学含义（P>0.05）。见表1。
3.3 松龄血脉康胶囊对氧化应激相关基因的调控剖析
3.3.1 松龄血脉康组与模型组比较，差异表达基因成果
本研讨经过qPCR阵列检测，共筛到75个有改变基因。高剂量松龄血脉康组与模型组比较差异倍数大于2的基因有9个，其间Gch1、FOS、IGF1R基因上调，PIK3CG、GPx2、CAV1、SOD1、PTEN、HSPA1B基因表达量下调（见表2）。
3.3.2 凭借String数据渠道对差异表达基因剖析成果
String数据库能够对多个基因进行网络剖析，将差异表达基因Gch1、FOS、IGF1R、PIK3CG、GPx2、CAV1、SOD1、PTEN及HSPA1B放入该数据库进行剖析得到。见图2。从图中能够看出FOS、IGF1R、PIK3CG、CAV1及PTEN关系密切，经过查閱文献发现IGF1R及CAV1与氧化应激密切相关。
4 讨 论
高血壓病是遗传和环境要素一起效果的成果，其发病机制没有彻底清晰，现在以为血压反常升高与肾素-血管严重素醛固酮体系激活、交感神经反常振奋、钠摄入过多等有关，不论何种要素，均无法全面解说高血压病的机制。跟着对高血压机制研讨的深化，人们越来越认识到氧化应激在高血压病中的重要效果。松龄血脉康胶囊主由葛根、鲜松叶、珍珠层粉组成，具有平肝潜阳、镇心安神的成效。长时间继续高血压可引起全身动脉疾病，表现为动脉中层滑润肌细胞增殖和纤维化、管壁增厚和管腔狭隘，本研讨中松龄血脉康胶囊能改进动脉纤维化程度，但这种药效是继发于大鼠血压的下降，仍是药物直接效果于动脉取得的效果，还尚待研讨。此外，松龄血脉康可减轻长时间高血压状态下大鼠主动脉氧化应激损害，该效果或许与松龄血脉康调理小凹蛋白（caveolin，CAV1）和胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）基因表达有关。
小凹是由小凹蛋白、胆固醇及鞘脂一起组成的具有转运胆固醇、信号传导等功用的细胞结构。小凹蛋白是组成小凹的首要骨架蛋白，可负性调控很多蛋白酶活性。CAV1是小凹构成不行短少的的要害蛋白之一，在血管内皮细胞、滑润肌细胞散布广泛，可经过其脚手架域中相关的氨基酸残基来完成其对其他蛋白活性的调控[4]。内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）是细胞膜小凹上发现的第一个非受体蛋白，研讨发现，CAV1经过其脚手架域，与eNOS相互效果并按捺eNOS活性，负性调控NO生成[5]。Drab等[6]用CAV1基因敲除小鼠，发现根底状态下NO、cGMP的表达都显着高于野生型鼠，短少CAV1蛋白小鼠的主动脉短少安稳的缩短力，乙酰胆碱干预后舒张反响添加，对苯肾上腺素的反响下降。提示CAV1的短少或许使肌张力下降，全身血压下降[7]。本研讨中CAV1基因表达下调，提示松龄血脉康胶囊或许经过下降CAV1表达，添加NO生成。
胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）是一种多肽类物质，是体内多种细胞自排泄和旁排泄的产品。在体内有胰岛素样效果，在体外能促进细胞增殖。在氧化应激状态下，血管滑润肌细胞IGF1R表达遭到按捺，这或许与p53和HDAC蛋白激活有关[8]。Baregamian等[9]用过氧化氢氧化损害大鼠肠上皮细胞，发现经过按捺IGF1R的表达，添加细胞凋亡，提示IGF1R有抗氧化应激维护肠上皮细胞的效果。Amina等[10] 用6-羟基多巴胺注入大鼠纹状体，制造多巴胺短少的帕金森模型，后给予IGF1医治，发现IGF1能维护黑质和纹状体，削减氧化损害，一起也发现这种维护效果先于AKT、ERK1/2等促生计因子的激活，提示IGF1相同有抗氧化应激效果。本研讨中大剂量松龄血脉康组IGF1R基因表达量较模型组上调2倍，提示IGF1R或许参加主动脉的氧化应激中，松龄血脉康或许经过调理IGF1R表达抗氧化应激、维护血管功用。
受体内化不仅仅是完毕受体及配体的活性态，一起是其调控下流效应器的调理信号。Martins等[11]研讨发现CAV1参加尤文肉瘤细胞质膜上IGF1受体内化，对IGF1受体内化有按捺效果，下流AKT和MAPK磷酸化也会遭到按捺。Tang等[12]也发现在肝癌细胞中，CAV1过表达能添加IGF1R表达然后激活PI3K/Akt及RAF/MEK/ERK通路。可见CAV1与IGF1R关系密切。但这些研讨仅限于肿瘤试验，在高血压及氧化应激中CAV1是否影响IGF1R活性尚待深化。
参阅文献
[1] Guzik T J，Touyz R M.Oxidative Stress，Inflammation，and Vascular Aging in Hypertension[J].Hypertension，2017：117-7802.
[2] Dikalov S I，Dikalova A E.Contribution of mitochondrial oxidative stress to hypertension[J].Curr Opin Nephrol Hypertens，2016， 25（2）：73-80.
[3] 施伟丽，王 燕，信琪琪，等.松龄血脉康胶囊对自发性高血压大鼠高血压相关基因表达的影响[J].我国中医根底医学杂志，2017（05）：634-637.
[4] Bucci M，Gratton J P，Rudic R D，et al. In vivo delivery of the caveolin-1 scaffolding domain inhibits nitric oxide synthesis and reduces inflammation[J].Nat Med，2000，6（12）：1362-1367.
[5] Dessy C，Feron O，Balligand J.The regulation of endothelial nitric oxide synthase by caveolin：a paradigm validated in vivo and shared by the 'endothelium-derived hyperpolarizing factor'[J].Pflügers Archiv-European Journal of Physiology，2010，459（6）：817-827.
[6] Drab M，Verkade P，Elger M， et al.Loss of caveolae，vascular dysfunction，and pulmonary defects in caveolin-1 gene-disrupted mice[J].Science，2001，293（5539）：2449-2452.
[7] Albinsson S， Shakirova Y， Rippe A， et al. Arterial remodeling and plasma volume expansion in caveolin-1-deficient mice[J]. AJP： Regulatory， Integrative and Comparative Physiology，2007， 293（3）：R1222-R1231.
[8] Kavurma M M，Figg N，Bennett M R，et al.Oxidative stress regulates IGF1R expression in vascular smooth-muscle cells via p53 and HDAC recruitment[J].Biochem J，2007，407（1）：79-87.
[9] Baregamian N，Song J，Chung D.Effects of Oxidative Stress on Intestinal Type I Insulin-Like Growth Factor Receptor Expression[J].European Journal of Pediatric Surgery，2012，22（01）： 97-104.
[10] Ayadi A E，Zigmond M J，Smith A D.IGF-1 protects dopamine neurons against oxidative stress：association with changes in phosphokinases[J]. Exp Brain Res，2016，234（7）：1863-1873.
[11] Martins A S，Ordonez J L，Amaral A T， et al. IGF1R signaling in Ewing sarcoma is shaped by clathrin-/caveolin-dependent endocytosis[J].PLoS One，2011，6（5）：e19846.
[12] Tang W，Feng X，Zhang S，et al.Caveolin-1 Confers Resistance of Hepatoma Cells to Anoikis by Activating IGF-1 Pathway[J].Cell Physiol Biochem，2015，36（3）：1223-1236.
