尹丽颖+李凤金+仲丽丽+敖鹏+张妍妍+边晓燕+唐丹丽
摘要：意图 评论辽东楤木叶总皂苷（ETS）诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡及其对凋亡相关蛋白表达的影响。办法 MTT法检测不同浓度（6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg）ETS培育的结肠癌HT-29细胞增殖率，Hoechst33258染色和激光共聚集成像检测细胞凋亡，并调查凋亡细胞的形状学改动，免疫组化检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。成果 ETS可诱导HT-29细胞发作凋亡，且凋亡效果在必定范围内呈剂量依赖性；ETS可使HT-29细胞Bcl-2表达下降、Bax表达升高（P<0.05，P<0.01），且呈显着的量效联系。定论 ETS可诱导HT-29细胞凋亡，其凋亡机制或许与下降Bcl-2、升高Bax的表达相关。
关键词：辽东楤木叶总皂苷；HT-29细胞；细胞凋亡；Bcl-2；Bax
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）06-0049-04
Abstract： Objective To study the apoptosis of human colorectal cancer HT-29 cells induced by Aralia elata Seem leaf total saponin （ETS） and its effects on the expression of relevant proteins. Methods MTT assay was used to detect the proliferation of human colorectal cancer HT-29 cells cultivated with different concentrations （6.25， 12.5， 25， 50， 100， 200 mg/kg） of ETS. Hoechst33258 staining and laser confocal imaging were used to detect the apoptotic cells. Morphological changes were observed. The expressions of Bcl-2 and Bax were detected by immuno- histochemistry. Results ETS could induce apoptosis of HT-29 cells and apoptosis was in a dose-dependent manner in a certain range. ETS could decrease the expression of Bcl-2 and increase the expression of Bax in HT-29 cells （P<0.05， P<0.01）， showing a significant dose-effect relationship. Conclusion ETS can induce the apoptosis of HT-29 cells， and the mechanism may be related to reducing the expression of Bcl-2 and increasing the expression of Bax.
Key words： Aralia elata Seem leaf total saponin； HT-29 cells； cell apoptosis； Bcl-2； Bax
隨着我国人民生活水平的进步，全民的膳食结构发作了严重改动，结肠癌的发病率和死亡率也随之升高[1]。现在除传统手术、放化疗等手法外，中医药医治结肠癌越来越遭到喜爱。本课题组前期研讨发现，辽东楤木叶总皂苷（total saponine of Aralia Elata Seem leaves，ETS）具有杰出的抗肿瘤效果，且对人结肠癌效果效果显着，但其效果机制尚不十分清晰[2]。本试验选用MTT法检测人结肠癌HT-29细胞增殖率，经过Hoechst33258染色、激光共聚集成像等办法检测细胞凋亡，调查ETS对凋亡细胞形状的影响，并用免疫
组化检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，评论ETS对HT-29细胞凋亡的诱导效果及其或许的机制。
1 试验材料
1.1 药物和细胞株
ETS由黑龙江中医药大学药理教研室供给；人结肠癌HT-29细胞株由我国医学科学院基础医学研讨所供给。
1.2 首要试剂与仪器
MTT（美国Sigma公司，批号0793）；hyclone PRMI-1640培育基（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司，批号AAJ206662）；胎牛血清（TBD，批号OW20150122-0256）；Hoechst33258荧光染液（碧云天生物技术研讨所，批号20131105）；抗Bcl-2抗体（Sant Cruz，批号14H80415）；抗Bax抗体（Sant Cruz， 批号14V70207）；S-P Kit试剂盒（福州迈新试剂公司，批号SA1052）。激光共聚集显微镜（德国ZEISS公司），CO2培育箱（HF90/HF240力新仪器上海有限公司），荧光显微镜（德国Leica），电热恒温水浴锅（DK-S24，上海森信试验仪器有限公司），低速离心机（LDZ4-1.2，北京医用离心机厂），MILLI-Q超纯净水纯化体系（北京同德创业科技有限公司）。
2 试验办法
2.1 细胞培育
惯例培育HT-29细胞至80%～90%融合时，PBS冲刷后参加含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶1 mL消化，低速离心。弃上清液，参加新鲜培育基，分装后于5%CO2、37 ℃下培育备用。
2.2 细胞增殖检测
取对数成长期HT-29细胞，调整浓度至1×105/mL，接种于96孔板上，每孔100 μL悬液，每组6个复孔，5%CO2、37 ℃孵育24 h，随后顺次参加不同浓度的ETS加药培育基（6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg），对照组参加等体积空白培育基。48 h后弃培育基，参加MTT溶液，5%CO2、37 ℃孵育4 h，参加DMSO溶液，37 ℃溶解10 min，于酶标仪波长570 nm处测定吸光度（OD），核算细胞按捺率[（1-受试药组均匀OD值÷对照组均匀OD值）×100%]。
2.3 细胞核染色
按“2.1”项办法培育细胞。于6孔板中进行细胞爬片，培育24 h后给药组参加含不同浓度（10、20、40 mg/kg）ETS的1640培育基2 mL，对照组参加等体积1640培育基。培育48 h后，弃培育液，PBS冲刷，4%多聚甲醛0.5 mL固定10 min，PBS冲刷2次，参加Hoechst33258染色液，5 min后PBS冲刷2次，天然晒干，荧光显微镜调查并摄影。
2.4 细胞凋亡检测
按 “2.3”项下办法培育细胞。培育48 h后弃培育液，PBS冲刷2次×2 min，参加200 μL Binding Buffer，再参加10 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI，室温避光染色15 min，最终参加300 μL Binding Buffer，激光扫描共聚集显微镜检测。
2.5 Bcl-2、Bax表达检测
按 “2.3”项下办法培育细胞。培育48 h后弃培育液，PBS冲刷2次×2 min，4%多聚甲醛固定，PBS冲刷3次×3 min，参加PBS制造新鲜的3%H2O2，室温孵育10 min灭活内源酶后，PBS冲刷3次×3 min，随后参加正常山羊血清封闭液，室温20 min。冲刷后参加抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体及抗GAPDH抗体（1∶200稀释），4 ℃过夜，PBS冲刷后参加辣根过氧化物酶符号二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲刷后DAB显色，苏木素复染，脱水、通明、封片、镜检。高清晰图文剖析体系对图画进行剖析，以核膜或胞质中呈现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性区域，随机选取5个400倍视界核算阳性细胞率。
3 计算学办法
选用SPSS19.0计算软件进行剖析。计量材料以—x±s标明，组间比较选用单要素方差剖析。P<0.05标明差异有计算学含义。
4 成果
4.1 辽东楤木叶总皂苷对人结肠癌HT-29细胞增殖的影响
不同浓度ETS对HT-29细胞有不同程度的增殖按捺效果，并呈剂量依赖性。50、100、200 mg/kg ETS组较对照组差异有计算学含义（P<0.01）。见表1。
4.2 Hoechst33258染色细胞核成果
与对照组细胞核均匀淡蓝色比较，经ETS处理后，HT-29细胞核呈亮蓝色浓染，阐明细胞核染色质发作了固缩，致使细胞核与Hoechst33258的结合才能增强，且随浓度的添加，亮蓝染色的份额添加。成果见图1。
4.3 AnnexinV-FITC/PI双染法细胞凋亡成果
对照组细胞结构完好，呈不规则三角形，无染色或仅有弱小的绿色荧光。经ETS干涉24 h后，各组均可见很多凋亡细胞，且随浓度的添加，凋亡细胞份额升高。前期凋亡的细胞仅在细胞膜处呈绿色荧光，细胞核不上色；中、晚期凋亡的细胞则细胞膜处呈现绿色荧光，细胞核处呈现赤色荧光。成果见图2。
4.4 辽东楤木叶总皂苷对人结肠癌HT-29细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响
与对照组比较，各浓度ETS组可见Bcl-2蛋白表达明显下降、Bax蛋白表达明显升高（P<0.05，P<0.01），见表2。Bcl-2形状学表现为胞膜及胞浆中棕黄色颗粒削减，见图3；Bax形状学表现为胞膜及胞浆中棕黄色颗粒增多，见图4。
5 评论
中药辽东楤木具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛的成效，可用于医治神经衰弱、风湿性关节炎、肝炎、糖尿病等肾气缺乏之证[3]。现代药理研讨显现，ETS具有按捺癌细胞成长的效果[4]，对人结肠癌HT-29细胞效果尤为明显[5]。但其是否与诱导细胞凋亡有关尚不清晰，本研讨经过检测凋亡相关目标进一步评论其对人结肠癌HT-29细胞的效果机制。
细胞凋亡反常与许多疾病尤其是癌症的发作开展有着密切联系。近年来，运用细胞凋亡手法研讨中药抗癌机制成为热门[6-7]。Hoechst33258染色是经过对细胞核染色质进行染色对细胞核的形状进行调查。本试验成果显现，经ETS干涉的细胞呈现不同程度细密浓染颗粒且在必定范围内与浓度呈正相关，标明ETS具有诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡的效果。
AnnexinV-FITC/PI双染法是区别凋亡前期及中晚期细胞的有用办法。本试验成果显现，不同浓度ETS对HT-29细胞均可发作诱导凋亡的效果，且随浓度的添加中晚期凋亡细胞添加。
肿瘤的发作、开展与细胞的过度增殖、正常凋亡遭到按捺两个要素相关。因而，研讨凋亡相关蛋白的表达成为研讨抗肿瘤药物效果机制的重要途径之一[8]。Bcl-2是现在发现最重要的按捺肿瘤细胞凋亡的基因，而Bax作为Bcl-2宗族的一员，具有Bcl促细胞凋亡功用，Bax和Bcl-2经过构成同源或异源二聚体来调理细胞凋亡[9]。本研讨发现，不同浓度ETS能影响HT-29细胞Bcl-2和Bax的表达，其间Bcl-2蛋白表达明显下降，而Bax蛋白表达明显上升。
综上，本研讨成果标明，ETS具有诱导人结肠癌HT-29细胞发作凋亡的效果，其机制或许与其调理凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达相关。
参考文献：
[1] 伍雯，秦环龙.膳食结构改动与结肠癌危险相关性的研讨进展[J].肠外与肠内养分，2014，21（1）：55-59.
[2] 尹丽颖，边晓燕，肖洪彬.辽东楤木叶总皂苷对荷瘤小鼠抑瘤效果的试验研讨[J].中医药信息，2010，27（3）：107-109.
[3] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977：2583.
[4] 王旭彤，王玲.辽东楤木皂苷体内外抗肿瘤效果的试验研讨[J].黑龙江医药，2007，20（3）：210-211.
[5] 尹丽颖，李凤金，边晓燕，等.辽东楤木叶总皂苷对结肠癌HT-29细胞的成长按捺效果及机制研讨[J].我国药理学通报，2013，29（11）：1545- 1548.
[6] 李忠，刘耀，李洁，等.中医肿瘤学科现状剖析与开展思路[J].中医学报，2010，25（1）：10-16.
[7] 龙石银，张彩平，高细强，等.NF-κB/IKB在二苯乙烯苷按捺过氧化氢诱导内皮细胞凋亡中的表达改变[J].我国药理学通报，2011，27（10）：1353-1357.
[8] 张欣，李蕊洁.中药调控肿瘤细胞凋亡相关基因的研讨进展[J].湖南中医杂志，2015，31（5）：196-197.
[9] 朱玲，羅颂平，许丽绵，等.左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白表达的影响[J].中药新药与临床药理，2012，23（4）：381-386.
（收稿日期：2016-06-21）
（修回日期：2016-07-29；修改：华强）
