张玉琴+孙承韬+李煌+徐伟+褚克丹+林羽
摘要：意图 调查栝楼桂枝颗粒对谷氨酸诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）兴奋性毒性损害的影响，并开始评论其效果机制。办法 选用谷氨酸诱导PC12兴奋性毒性损害造模。将细胞随机分为正常组、谷氨酸组和栝楼桂枝颗粒低（200 μg/mL）、中（400 μg/mL）、高（800 μg/mL）剂量组，MTT法和LDH法检测PC12生机；Caspase-3活性检测法、Annexine V/PI双染色法检测细胞凋亡，Western blot和RT-PCR别离检测Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表达。成果 与谷氨酸组比较，MTT法栝楼桂枝颗粒各剂量组PC12生机升高，LDH法栝楼桂枝颗粒各剂量组细胞生机下降；Annexine V/PI双染色法栝楼桂枝颗粒各剂量组PC12凋亡率下降；Caspase-3活性检测法栝楼桂枝颗粒各剂量组Caspase-3活性下降；RT-PCR及Western blot检测栝楼桂枝颗粒各剂量组Bax表达下降、Bcl-2表达升高。定论 栝楼桂枝颗粒对谷氨酸诱导PC12兴奋性毒性损害有必定的维护效果，其维护效果与其抗细胞凋亡效果有关。
要害词：栝楼桂枝颗粒；谷氨酸；肾上腺嗜铬细胞瘤细胞；细胞凋亡
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.010
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）06-0039-05
Abstract： Objective To investigate the effects of Gualou Guizhi Granules on excitatory toxic damage of PC12 induced by glutamate； To primarily explore the involved protective mechanism of Gualou Guizhi Granules. Methods Excitatory toxic damage of PC12 induced by glutamate was used to establish models. Cells were divided into normal group， glutamate group， and Gualou Guizhi Granules low- （200 μg/mL）， medium- （400 μg/mL） and high-dose （800 μg/mL） groups. MTT and LDH assay methods were used to detect PC12 activity； Caspase-3 activity detection method and Annexine V/PI double staining method were used to detect cell apoptosis； Western blot and RT-PCR were used to detect Bcl-2， Bax protein and mRNA expression. Results Compared with glutamate group， MTT showed that all Gualou Guizhi Granules groups could improve PC12 activity， and LDH showed that cell activity in all Gualou Guizhi Granules groups decreased； Annexine V/PI double staining method showed that all Gualou Guizhi Granules groups could decrease the PC12 apoptosis； Caspase-3 activity detection method showed that all Gualou Guizhi Granules groups could decrease the activity of Caspase-3； Western blot and RT-PCR showed that all Gualou Guizhi Granules groups could reduce Bax expression and increase Bcl-2 expression. Conclusion Gualou Guizhi Granules have certain protective effects on excitatory toxic damage of PC12 induced by glutamate， which may be related to its anti-apoptotic activity.
Key words： Gualou Guizhi Granules； glutamate； PC12； cell apoptosis
隨着国际老龄化的加重，脑卒中成为发展我国家
高致残率、高逝世率、高发病率的一种疾病，给人类健康造成了巨大的要挟。栝楼桂枝颗粒（处方源于栝楼桂枝汤）为福建省第二人民医院院内制剂，临床用于医治脑卒中后痉挛性偏瘫。临床调查显现，栝楼桂枝汤可显着改进中风后患者运动功用、痉挛状况及日常日子活动能力[1]。体表里研讨也标明，栝楼桂枝汤具有抗氧化、抗炎及抗兴奋性氨基酸毒性损害的效果[2-7]。本研讨在前期试验的根底上，选用谷氨酸诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）兴奋性毒性损害为模型，调查其对模型大鼠的影响，并开始评论其效果机制，为临床使用供给必定的试验依据。
1 试验资料
1.1 细胞
高分解大鼠PC12，北京北纳创联生物技术研讨所。
1.2 药物及制备
栝楼桂枝颗粒，福建省第二人民医院药剂科供给，无菌条件下用含1%胎牛血清1640培育基制造成1 mg/mL的母液，使用时稀释成不同浓度的工作液。
1.3 首要试剂与仪器
谷氨酸，Sigma公司；噻唑蓝（MTT），Sigma公司；Annexin V/PI凋亡试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，上海碧云天生物技术公司；Caspase-3 Assay Kit，Molecular Probes；兔抗大鼠Bcl-2、Bax和β-actin抗体，Cell Signalling公司；辣根过氧化酶符号羊抗兔IgG，厦门鹭隆生物科技发展有限公司；RevertAidTM First strand cDNA Synthsis Kit，Fermenta公司；Power SYBR? Green PCR Master Mix，Life Sciences公司。凝胶成像仪，美国伯乐公司；PCR扩增仪，美国伯乐公司；7900型荧光定量PCR仪，ABI公司。
2 试验办法
2.1 细胞增殖检测
将对数期PC12接种至96孔板（2×104个/孔），将细胞随机分为正常组、谷氨酸组和栝楼桂枝颗粒低、中、高剂量组，每组6孔，试验重复3次。培育24 h后，栝楼桂枝颗粒低、中、高剂量组别离参加200、400、800 μg/mL栝楼桂枝颗粒药液，24 h后参加谷氨酸（终浓度为15 mmol/L），持续培育6 h后，每孔参加10 ?L浓度为5 mg/mL MTT，持续培育4 h后，吸弃培育上清液，每孔加100 ?L DMSO溶解甲瓒结晶，室温震摇5 min，彻底溶解后，于酶标仪570 nm处测定光密度（OD）。核算细胞存活率（试验组OD值÷正常组OD值×100%）。
2.2 细胞生机检测
分组、给药办法同“2.1”项，24 h后参加谷氨酸（终浓度为15 mmol/L），持续培育6 h后，取细胞上清液，LDH法检测PC12生机，严厉依照试剂盒说明书进行操作。于波长450 nm处测定OD值，核算细胞生机。细胞生机（U/L）=（测定管OD值-对看管OD值）÷（规范管OD值-空白管OD值）×规范品浓度（0.2 mmol/L）×1000。
2.3 细胞凋亡检测
分组、给药办法同“2.1”项，24 h后参加谷氨酸（终浓度为15 mmol/L），持续培育6 h后，搜集细胞，向细胞沉积中参加Binding Buffer 500 ?L，重悬细胞。混匀后，参加5 ?L Annexin V-FITC，混合均匀，参加5 ?L PI溶液，悄悄混合均匀，室温下避光孵育15 min，1 h内流式细胞仪剖析细胞凋亡。
2.4 Caspase-3活性检测
分组、给药办法同“2.1”项，24 h后参加谷氨酸（终浓度为15 mmol/L），持续培育6 h后，搜集细胞，参加50 ?L预冷的Cell Lysis Buffer，冰上孵育30 min，5000 r/min离心5 min，汲取上清液置于新的离心管，置于冰上待用，BCA法测定样品蛋白含量。用Cell Lysis Buffer稀释必定量的蛋白至50 ?L，参加96孔板，再参加50 ?L 2×底物工作液（含DTT 0.495 ?mol，Z-DEVD-R110 0.012 5 ?mol），室温孵育30～60 min，待色彩发作显着改变时，于酶标仪波长405 nm处测定OD值。核算蛋白含量规范化校对后A值[（测定孔OD值-无酶孔OD值）×待测样品蛋白浓度]，以正常组Caspase-3活性为1，以每个样本的校对A值除以正常组校对A值的商核算各组Caspase-3相对活性（处理组校对A值÷正常组校对A值）。
2.5 Bax、Bcl-2 mRNA表达检测
2.5.1 总RNA提取 Trizol法提取总RNA，微量紫外分光光度计检测A260、A280，取A260/A280在1.8～2.0样品进行试验，并核算总RNA浓度。
2.5.2 实时PCR检测 依据浓度核算2 ?g样本RNA体积，依照RevertAidTM First strand cDNA Synthsis Kit试剂盒说明书制造20 ?L的反转录系统。轻柔混匀，低速离心，于PCR仪进行反转录反响，反转录取得cDNA。各意图基因引物由上海生工生物工程有限公司组成，意图基因引物序列见表1。依照试剂盒制造20 ?L的扩增系统：Power SYBR Green PCR Master Mix（2×）10 ?L，引物各2 ?L，cDNA 1 ?L，Nuclease-free water 1 ?L。Real-time PCR检测以β-actin为内参基因，核算谷氨酸组和给药组相关于正常组意图基因的表达量，终究成果用相对表达量2-ΔΔct标明。
2.6 Bcl-2、Bax蛋白表達检测
选用Western blot检测。用含1%PMSF的蛋白裂解液提取蛋白，并按BCA蛋白测定说明书对每组蛋白含量进行测定，样品经12%凝胶电泳分离、转膜、关闭，将膜与溶于关闭液中一抗4 ℃孵育过夜。将膜浸入二抗稀释液，室温孵浴1 h 洗刷，在暗室内将ECL显影液加到膜的蛋白面，静置1 min，充沛显色后，曝光，凝胶成像仪显影、摄影，使用凝胶图画剖析软件剖析各意图蛋白相对表达量，β-actin为内参基因，并核算方针蛋白与内参的比值。
3 计算学办法
选用SPSS17.0计算软件进行剖析。试验成果以—x±s标明，组间比较用方差剖析。P<0.05标明差异有计算学含义。
4 成果
4.1 栝楼桂枝颗粒对谷氨酸诱导损害PC12增殖的影响
MTT法显现，谷氨酸组较正常组PC12生机显着下降（P<0.05），栝楼桂枝颗粒高、中剂量组PC12生机较谷氨酸组显着升高（P<0.05），见图1。LDH法显现，谷氨酸组较正常组PC12生机显着升高（P<0.05），栝楼桂枝颗粒各剂量组PC12生机较谷氨酸组改变不显着，见图2。
4.2 栝楼桂枝颗粒对谷氨酸诱导损害PC12凋亡的影响
与正常组比较，谷氨酸组PC12凋亡率升高；与谷氨酸组比较，栝楼桂枝颗粒各剂量组PC12凋亡率下降，见图3。
活性的影响
与正常组比较，谷氨酸组PC12 Caspase-3活性显着升高（P<0.01）；与谷氨酸组比较，栝楼桂枝颗粒各剂量组PC12 Caspase-3活性显着下降（P<0.05）。成果见表2。
4.4 栝楼桂枝颗粒对谷氨酸诱导损害PC12 Bcl-2、Bax mRNA表达的影响
与正常组比较，谷氨酸组PC12 Bcl-2基因表达下降、Bax基因表达显着升高（P<0.05，P<0.01）；与谷氨酸组比较，栝楼桂枝颗粒各剂量组PC12 Bax基因表达下降、Bcl-2基因表达升高，栝楼桂枝颗粒高剂量组差异显着（P<0.05）。結果见图4。
4.5 栝楼桂枝颗粒对谷氨酸诱导损害PC12 Bcl-2、Bax蛋白表达的影响
与正常组比较，谷氨酸组PC12 Bcl-2、Bax蛋白表达显着下降（P<0.01）；与谷氨酸组比较，栝楼桂枝颗粒各剂量组PC12 Bax、Bcl-2蛋白表达增强，栝楼桂枝颗粒高剂量组差异显着（P<0.01）。成果见图5。
5 评论
栝楼桂枝颗粒处方来源于张仲景《金匮要略》，由天花粉、白芍、桂枝、甘草、生姜、大枣6味药组成。方中天花粉清热生津而润燥养筋、舒缓筋脉；一起以桂枝汤为根底方，刚柔相济，开阖相佐，发汗解肌、温经通脉、助阳化气、散寒止痛。诸药配伍，结构谨慎，邪正统筹，阴阳并补，气血双调，柔润筋脉，缓痉之急，能够解肌和营、生津柔筋，临床用于医治脑卒中后痉挛性偏瘫。
脑卒中发作机制是一个杂乱的级联反响进程，其间谷氨酸诱导细胞发作兴奋性或氧化应激损害的进程包含多种信号传导途径的参加，其机制比较杂乱。研讨标明，抗凋亡蛋白Bcl-2基因宗族和Caspase蛋白酶宗族在细胞凋亡进程中发挥着重要的效果[8]。Bcl-2是一种抗凋亡的基因，Bcl-2过度表达可有用下降神经元的损害，其原因可能与线粒体膜的安稳与完好有关[9]。当无凋亡要素存在时，它和Bax一起保持细胞膜的完好性，按捺线粒体凋亡。遭到凋亡影响时，Bcl-2与Bax生成二聚体开释Bax，导致细胞凋亡。因而，Bcl-2/Bax比值关于细胞凋亡至关重要[10]。富苏等[11]发现通络化痰胶囊能下调缺血半暗带Bax表达，促进Bcl-2表达，削减细胞凋亡水平，促进脑缺血损害大鼠的神经功用的康复。本试验经过Western Blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达，发现栝楼桂枝颗粒能上调Bcl-2的表达，进步Bcl-2/Bax比值，标明栝楼桂枝颗粒可起到抗凋亡的效果，且RT-PCR的成果进一步验证了其抗凋亡效果。
作为半胱氨酸蛋白酶宗族中一员，Caspase-3在凋亡细胞逝世级联进程中起着重要效果[12]。它是凋亡细胞通路中的下流蛋白，能够必定的氨基酸序列剪接成多种活性的要害蛋白，在哺乳动物细胞凋亡进程中起着重要效果[13]。无论是fas配体途径活化Caspase-8，仍是线粒体途径进程中活化Caspase-9，都能导致Caspase-3激活，引起Caspase-3级联反响，终究导致细胞凋亡[14]。体内研讨成果标明，高浓度谷氨酸能够激活细胞内Caspase-3蛋白的表达，参加谷氨酸诱导的PC12凋亡[15]。
Caspase-3能够催化底物Z-DEVD-R110分解出R110，宣布荧光，一旦Caspase-3发作剪切，就能够使无荧光的底物发作荧光，且Caspase-3的活性与荧光呈正相关。本试验成果标明，谷氨酸处理细胞后，Caspase-3相对活性明显升高，标明细胞发作凋亡。而参加栝楼桂枝颗粒后，Caspase-3相对活性明显下降，凋亡通路遭到按捺，标明栝楼桂枝颗粒能按捺谷氨酸引起的细胞凋亡，起到必定的维护效果。
综上，栝楼桂枝颗粒能下降PC12 Caspase-3活性，进步Bcl-2/Bax比值，对谷氨酸诱导PC12损害有维护效果，其机制可能与抗细胞凋亡有关。但这仅仅部分调理凋亡相关基因研讨，详细是否经过调理炎症因子等其他途径完成其维护效果，有待进一步研讨其多层次、多基因的神经维护效果。
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（收稿日期：2016-09-19）
（修回日期：2016-10-13；修改：华强）
