李澎++王建农++许勇刚++付建华++刘建勋
摘要：意图 调查山楂叶原花青素对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和E-挑选素过表达的影响，评论其抗炎效果的机制。办法 体外培育人脐静脉内皮细胞。MTT法检测细胞生机，流式细胞术检测ICAM-1和E-挑选素的表达。成果 山楂叶原花青素浓度≤200 mg/L时，对细胞生机无显着影响；模型组人脐静脉内皮细胞ICAM-1和E-挑选素表达较正常组显着升高，10、20、30、40、50 mg/L山楂叶原花青素浓度依靠地按捺ICAM-1和E-挑选素的表达升高，其间40、50 mg/L组较模型组差异有计算学含义。定论 山楂叶原花青素能够按捺TNF-α诱导的血管内皮细胞ICAM-1和E-挑选素的过表达，这或许与其抗炎效果相关。
要害词：山楂叶；原花青素；血管内皮细胞；肿瘤坏死因子-α；细胞间黏附分子-1；E-挑选素
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）08-0050-04
Effects of Hawthorn Leaf Procyanidins on Over expressions of ICAM-1 and E-selectin in Human Umbilical Vein Endothelial Cells Induced by TNF-α LI Peng， WANG Jian-nong， XU Yong-gang， FU Jian-hua， LIU Jian-xun （Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China）
Abstract： Objective To observe the effects of hawthorn leaf procyanidins （HLP） on over expressions of ICAM-1 and E-selectin in human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） induced by TNF-α，and clarify the mechanism of HLPs anti-inflammation effect. Methods HUVEC were cultured in vitro. MTT assay was used to detect cell viabilities. The expressions of ICAM-1 and E-selectin in HUVEC were detected by flowcytometry. Results Up to 200 mg/L， HLP showed no significant decrease in cell viabilities； the expression levels of ICAM-1 and E-selectin in the model group significantly increased， compared with that in the normal group； 10， 20， 30， 40， 50 mg/L HLP inhibited the expression elevations of ICAM-1 and E-selectin in concentration-dependent manner； and there were statistical significances in 40， 50 mg/L HLP groups， compared with the model group. Conclusion HLP can inhibit the over expressions of ICAM-1 and E-selectin of vascular endothelial cells induced by TNF-α， which possibly underlies HLPs anti-inflammation effect.
Key words： hawthorn leaf； procyanidins； vascular endothelial cell； TNF-α； ICAM-1； E-selectin
過度的炎症反响是动脉粥样硬化、缺血性心脏病、中风、感染性休克等疾病开展、恶化甚至形成逝世的要害病理环节。因而，按捺炎症发作、阻断炎症反响进程，关于这些严峻难治疾病的医治具有重要含义。山楂叶具有活血化瘀、降脂消浊的成效。原花青素是山楂叶的重要活性成分，约占山楂叶黄酮类物质
基金项目：国家自然科学基金（81274196）；北京市自然科学基金（7092089）
通讯作者：付建华，E-mail：[email protected]
总量的20%。有研讨显现，原花青素可按捺炎症细胞的激活、下降炎症因子的开释，还能够直接对立氧自由基、氮过氧化物等炎症毒素对细胞的杀伤[1-2]。咱们前期研讨显现，富含原花青素的山楂叶提取物能按捺缺氧复氧诱导的白细胞与内皮细胞的黏附，下降白细胞黏附分子的表达[3]。可是，山楂叶原花青素对炎性反响中血管内皮细胞黏附分子表达的影响尚缺少研讨。本试验以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）影响人脐静脉内皮细胞，调查山楂叶原花青素对内皮细胞2种经典黏附分子，即细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和E-挑选素过表达的影响，评论其抗炎效果的机制。
1 试验资料
1.1 脐带
剖腹产健康婴儿无菌脐带，购自北京市海淀区妇幼保健院。
1.2 药物及制备
山楂叶原花青素，本院试验中心参照文献[4]办法制备。6倍体积60%乙醇加热山楂叶1 h，过滤，取滤液，收回至无醇味。经AB8树脂吸附，水洗至清。70%乙醇洗脱树脂至无色，搜集洗出液，收回至无醇味。加氯仿萃取2次，去除叶绿素，聚酰胺吸附，烘干。
1.3 試剂
原花青素规范品（纯度>95%，沃玛特公司，4852-22-6），Ⅰ型胶原酶（Gibco公司，17100-017），胰酶（Amesco公司，0458），内皮细胞培育基（M200-500）及其添加物（S003-10），Cascade公司。重组人TNF-α（CytoLab公司，300-01A），藻红蛋白（PE）符号小鼠单克隆抗人ICAM-1荧光抗体（BD公司，347977），异硫氰酸荧光素（FITC）符号小鼠单克隆抗人E-挑选素荧光抗体（R&D公司，BBA21），PE符号小鼠IgG2a（BD公司，349053），FITC符号小鼠IgG1（R&D公司，IC002F）。
1.4 仪器
Synergy 4多功能酶标仪，Biotek公司；Navios流式细胞检测仪，Beckman Coulter公司。
2 试验办法
2.1 山楂叶原花青素纯度测定
选用香草醛法，参照文献[5]办法进行。
2.2 人脐静脉内皮细胞的培育与判定
将内皮细胞培育添加物按1∶50的份额参加内皮细胞培育基，并参加青霉素和链霉素（终浓度分别为100 U/L和100 μg/L），制形成彻底内皮细胞培育基。取婴儿脐带，长约20 cm。PBS洗净血迹，从脐静脉上端刺进剪去针尖的12号针头，以止血钳固定。经过针头向脐静脉内注入PBS，冲刷3遍，洗净残血。以另一止血钳夹闭脐静脉下端，向脐静脉内注入以DMEM培育基制造的0.1%Ⅰ型胶原酶，取出针头，夹闭脐静脉上端。37 ℃消化15 min。搜集脐静脉内的消化液，PBS冲刷2～3遍，将流出液体与消化液兼并，1500 r/min离心10 min，取沉积。参加彻底内皮细胞培育基，每条脐带所得细胞约加5 mL。将细胞吹打均匀，参加培育瓶内，37 ℃、5%CO2培育。当细胞成长至80%交融时，进行传代。PBS冲刷3遍，0.25%胰酶37 ℃消化5 min，搜集细胞，1∶3传代。试验运用第3代细胞。免疫荧光检测血小板Ⅷ因子表达。
2.3 人脐静脉内皮细胞生机检测
细胞彻底交融成长后，弃去培育基，PBS洗3遍。参加含有药物的彻底内皮细胞培育基，持续培育。药物以DMSO溶解，按1∶1000份额参加培育基内。正常组给予含0.1 mL/L DMSO的培育基。24 h后弃去培育基，PBS洗3遍，培育板内参加1 g/L PBS制造的MTT溶液，持续培育4 h；弃去MTT液，培育板内参加DMSO，室温放置15 min，于波长490 nm处测定吸光度（OD）。
2.4 造模和给药
待细胞长满培育皿后，弃去培育基，PBS冲刷3遍。参加含有药物的彻底内皮细胞培育基，持续培育1 h。药物以DMSO溶解，按1∶1000份额参加培育基内。正常组和模型组给予含1 mL/L DMSO的培育基。之后，模型组和给药组按1∶1000份额向培育基内参加PBS制造的重组人TNF-α（终浓度10 μg/L），正常组给予等量PBS。持续培育4 h。
2.5 细胞间黏附分子-1和E-挑选素检测
弃去培育基，PBS洗3遍，0.01%胰酶-0.02%EDTA消化10 min。胎牛血清停止消化，搜集细胞，PBS洗3次。4 ℃、1500 r/min离心10 min，弃去上清液，参加10 μL PBS，吹打均匀，均匀分作2份。一份参加5 μL抗ICAM-1抗体和5 μL抗E-挑选素抗体，另一份参加5 μL PE符号小鼠IgG2a和10 μL FITC符号小鼠IgG1，作为同型对照。4 ℃、避光孵育30 min。4 ℃、1500 r/min离心10 min，弃去上清液，PBS洗1次。搜集细胞，每份细胞参加25 μL多聚甲醛固定15 min，参加250 μL PBS，4 ℃避光保存，24 h内测定。流式细胞术测定PE和FITC荧光强度，以同型对照调定检测规模。各样本荧光强度=测定管荧光强度-同型对看管荧光强度。每次试验每组只作1个样本，以对模型的表达按捺率（1-给药组样本荧光强度÷同次试验模型样本荧光强度）衡量药效。
3 计算学办法
选用SPSS16.0计算软件进行剖析。试验数据以—x±s标明，组间比较用方差剖析或Kolmogorov-Smirnov Test查验。P<0.05标明差异有计算学含义。
4 成果
4.1 山楂叶原花青素的纯度测定
0.006 25～0.1 g/L浓度规模内，规范品浓度与OD值呈杰出的线性相关。回归方程为原花青素浓度（g/L）=3.306 3×OD值-0.140 6，r2=0.998 3；山楂叶原花青素样品的测定点散布在规范品曲线的邻近，标明其纯度与规范品附近或稍高。见图1。
注：黑色点为原花青素规范品，赤色点为山楂叶原花青素
图1 山楂叶原花青素与原花青素规范品纯度比较
4.2 人脐静脉内皮细胞的培育与判定成果
培育的内皮细胞成梭形、卵圆形或多角形，交融成长时呈青石子铺路状，见图2。抗血小板Ⅷ因子免疫荧光染色均为阳性，阳性表达部位在胞浆，呈绿色；细胞核以DAPI染色呈蓝色，见图3。
4.3 山楂叶原花青素对人脐静脉内皮细胞生机的影响
与正常组比较，山楂叶原花青素25、50、100、200 mg/L组人脐静脉内皮细胞生机无显着差异，见表1。
4.4 山楂叶原花青素对肿瘤坏死因子-α诱导的人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子-1和E-挑选素过表达的影响
与正常组比较，模型组ICAM-1、E-挑选素荧光强度显着升高（P<0.01）；与模型组比较，山楂叶原花青素各浓度均可按捺ICAM-1、E-挑选素的表达升高，其间40、50 mg/L原花青素差异有计算学含义（P<0.05，P<0.01），見图4、表2。
5 评论
炎症是一种极其重要的病理进程。它是有血管生物体对损害要素做出的一种非特异性的反响，其首要表现为本质器官细胞的变性和逝世、血液成分和血细胞的渗出及炎性、安排间质细胞的增生。一方面，炎症反响有助于铲除感染病原体以及损害、逝世的细胞，对机体具有有利的影响；可是，过于激烈的炎症反响会涉及那些本来正常的安排，使其呈现严峻的水肿、缺血缺氧和代谢妨碍，并很多杀伤那些本来未呈现损害的细胞，然后导致严峻的附加损害[6]。
白细胞等炎症细胞黏附于血管内皮是炎症反响中最为要害的一环，它是炎症诱发一系列严峻损害的必要条件。白细胞黏附会堵塞微血管，阻止甚至终断血流供给，还会影响血液回流，形成安排水肿；黏附的白细胞进入安排深处，开释氧自由基、毒性细胞因子、水解酶等，直接导致细胞的变性与逝世及安排基质的崩解。白细胞黏附于血管内皮细胞依靠于它们各自外表的黏附分子，这些黏附分子经过受体配基样效果彼此结合，介导白细胞的黏附。
ICAM-1和E-挑选素是血管内皮细胞表达2个最重要的黏附分子。前者归于免疫球蛋白超宗族，经过与白细胞上整合素分子（包含CD11、CD18等）相效果，使白细胞与血管内皮细胞发生结实的结合。而后者归于挑选素宗族，与白细胞的E-挑选素配基相效果，介导黏附的前期进程，如白细胞与内皮细胞的接触及白细胞在内皮细胞上的翻滚等。它们的表达首要遭到炎性细胞因子的调控，TNF-α、白细胞介素-1等均具有很强的诱生效果。
山楂叶的首要活性成分是黄酮和原花青素。黄酮含量较高，约占提取物总量的80%，余下部分为原花青素。WS?1442为德国开发的一种山楂叶制剂，在当今临床上得到广泛的使用。对其抗心肌缺血效果的研讨标明，山楂叶提取物的药理效果首要依靠于原花青素而非含量更高的黄酮，添加提取物华夏花青素的含量能够显着改善效果[7]。
本研讨成果显现，在10～50 mg/L浓度规模内，山楂叶原花青素能剂量依靠地按捺TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM-1和E-挑选素的过表达，且按捺效果对药物浓度有必定的依靠性，并在40、50 mg/L到达顶峰。这一药物有用浓度规模与量效联系，与咱们对山楂叶原花青素抗心肌细胞缺氧损害的研讨成果是一起的，这也提示40～50 mg/L或许就是山楂叶原花青素干涉不同疾病的一起最佳规模[8]。结合山楂叶原花青素对人脐静脉内皮细胞的毒性试验成果，浓度高至200 mg/L的山楂叶原花青素也未显现出显着的细胞毒性，其有用效果的浓度规模是安全的。
至于山楂叶原花青素是怎么按捺炎症介质诱导的血管内皮细胞ICAM-1过表达的，咱们估测或许与其抗氧化的性质有关。有研讨标明，包含上调ICAM-1在内的绝大多数TNF-α的生物学效应，均是氧自由基依靠的[9]。其详细机制还需进一步试验验证。
综上所述，本研讨成果提示，山楂叶原花青素能按捺炎症反响中血管内皮细胞ICAM-1的表达上调，这或许是其抗炎机制之一。
参考文献：
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（收稿日期：2016-11-29）
（修回日期：2016-12-13；修改：华强）
